In vitro DNA AMPLİFİKASYONU PCR

1. In vitro DNA AMPLİFİKASYONUPCR Elektroforezis Doç.Dr.Öztürk ÖZDEMİR

2. In vitro DNA Amplifikasyonu • 1- Moleküler klonlama, DNA parçalarının, bakteri gibi basit yapılı organizmalarda çoğaltılmasıdır. • Bu yöntemde çoğaltılacak hedef DNA, • vektör adı verilen ekstra kromozomal DNA molekülüne (plazmid) transfer edilir. • Oluşan rekombinant plazmid ise uygun bir bakteri hücresine sokularak bakterinin çoğaltılmasıyla in vivo olarak amplifiye edilmiş olur

3. Kary Mullis c1983 http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR 2. DNA’nın çoğaltılabileceği bir teknik, 1983 de Kary Mullis adlı bir biyokimyacının geliştirdiği Polimeraz Zincir Reaksiyonu’dur. İlk kez başarılı in virto DNA amplifikasyonu Saiki ve ark. Tarafından 1985 yılında gerçekleştirildi.

4. Amplifikasyon yöntemlerinin gelişmesinde iki önemli nokta • termofilik Thermus aquaticus ‘tan ısıya stabil DNA polimeraz • bilgisayar kontrollü termal döngü cihazlarının geliştirilmesi

5. PCR’nun Kullanıldığı Alanlar • PCR’nin geliştirilmesi, moleküler biyoteknolojinin ve kullanım alanının da genişlemesine yol açmıştır • Moleküler biyoloji ve biomedikal araştırmalar • Bakteriyel, viral, fungal ve protozoal hastalık etkenlerinin teşhisi • Gıda, su ve yiyeceklerde bulunan mikroorganizmaların tanısı • Genetik bozukluklar ve kanser taramaları

6. Prenetal tanı ve cinsiyet belirlenmesi • Gen tedavisi ve DNA aşıları • Adli tıp’da suçlu teşhisi • Antropoloji

7. PCR’nun Çalışma Prensibi • · PCR küçük volumlar halinde hazırlanır • (0.5 ml’lik mikrofüj tüpüne, 100 ml hacminde materyal konur)

8. · PCR için gerekli malzemeler: • 1-Hedef diziyi taşıyan kalıp DNA • (az miktarda ve ilgisiz DNA’larla kontaminasyon sorun değildir) • 2-Kalıp DNA çift iplikleri ile eşleşebilen 2 tür oligonükleotid primeri (15-30 bazlık ve tek iplikli) • 3-Dört tür dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) • 4-Termostabil DNA polimeraz enzimi (Taq, Vent)

9. · Bu materyaller bir tampon çözeltisi içinde karıştırılır. MgCl2 gereklidir. · Thermal Cycler adı verilen özel bir cihaz kullanılarak DNA’nın amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu cihaz, PCR örneğini programlanan ısı derecelerinde ve istenilen sürelerde tutmaya yarar.

10. · Her bir PCR döngüsü üç aşamada gerçekleştirilir. • 1- Hedef DNA’nın denatürasyonu (95 oC de 5 dak.) • ds DNA’ nın birkaç saniyede ısı ile ss DNA’ ya ayrılmasıdır. • (döngüye başlamadan 3-5 dk ön ısıtma yapılabilir) • 2- Primerlerin bağlanması (42-52 oC de 5 dak.) • örnek 1-2dk bu ısıda tutularak primerlerin (spesifik sentetik oligonükleotitler) ss DNA’ daki hedef bölgelere hibridizasyonu sağlanır. • 3- Polimerizasyon (65-72 oC de 5 dak.) • polimeraz enzimi yardımı ile ss DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’ 3’ yönde uzatılmasıdır. • · Her döngüde elde edilen yeni DNA’lar bir sonraki için kalıp görevi gördüklerinden, 25-30 döngü sonunda, DNA’nın milyonlarca kopyası elde edilir.

11. Taq DNA polimeraz optimal uzama sırasında yani 72-78 °C arasında 2000 nükleotid/dakika hızında çalışır.

12. 5’ 3’ 3’ 5’ DNA 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ Polymerase Chain Reaction • In vitro DNA (gene) amplifikasyon tekniği >90°

13. 5’ 3’ 3’ 5’ Polymerase Chain Reaction 40–60°

14. 5’ 3’ 3’ 5’ Polymerase Chain Reaction 72°

15. >90° 40–60° 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 72° 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ Polymerase Chain Reaction

16. >90° 40–60° 5’ 3’ 72° 3’ 5’ Polymerase Chain Reaction

17. >90° 40–60° 72° Polymerase Chain Reaction

18. 2n x Polymerase Chain Reaction

19. PCR: 3 steps

22. PCR’nun Avantajları · Çabuk · Duyarlı · Yüksek özgüllüğe sahip

23. PCR’nun Dezavantajları • · Pahalı • · Kros reaksiyonlar/non-spesifik DNA • amplifikasyonu  Sterilite • · Yalancı pozitif/negatif değerlendirme  • Deneyimli personel

24. Her teknikte olduğu gibi PCR’da da optimizasyon şarttır. Yüksek özgüllüğü ve duyarlılığına rağmen; · düşük ürün miktarı · primerlerden kaynaklanabilen non-spesifik ürün eldesi · kontaminasyon sonucu yalancı pozitif sonuçlar gibi sorunlar yaşanabilmektedir. İyi bir teknik kadro ve pozitif/negatif kontroller kullanılarak bu sorunlar giderildiği taktirde PCR, biyoteknologların hayatını kolaylaştıran bir tekniktir.

29. PCR ile Saptanan Bakteriyel Patojenler • Bacillus antracis • Corynebacterium diphtheriae • Shigella sp • Vibrio cholerae • Mycobacterium avium • Mycobacterium tuberculosis

30. PCR ile Saptanan Viral Patojenler • Hepititis A,B,C,E,G • İnsan papillomavirus • HIV-I,II • Influenza virus • Rubella virus • Herpes simplex virus

31. PCR ile Saptanan Fungal Patojenler • Blastomyces dermatitis • Histoplasma capsulatum • Candida albicans • Pneumocyctis carinii

32. PCR ile Saptanan Protozoal Patojenler • Plasmodium falciparum • Leishmania sp • Toxoplasma gondii • Trypanosoma sp.

33. Amplifikasyon Ürünlerinin Tespit Edilmesi • PCR ile amplifiye edilen DNA’yı tespit etmenin bir yolu : • Elektroforez

34. powder + ion Cathode Anode Elektroforez prensibi

35. DNA proteinler ve birçok biyomoleküller gibi elektriksel yük taşır. • DNA negatif yüklüdür.Bu nedenle anoda doğru hareket eder.Yükleme katod tarafına yapılmalıdır. • DNA molekülleri şekilsel ve elektrik yükü bakımından benzer olduğundan elektroforez kriterlerine göre ayrılmaz • DNA molekülleri büyüklüklerine göre ancak bir jel içinde ayrılabilirler.

36. DNA molekülleri genellikle agaroz ya da poliakrilamid jel içinde elektroforez edilir. • Jellerin içerisinde DNA moleküllerinin girip hareket edebilecekleri porlar vardır. • Elektroforez ile ayrılan DNA’ yı görmek için ise etidyum bromid ile boyanır.(UV boya)

38. PCR - analiziJel-elektroforez

40. PCR: Viral detection

41. Tüm Aşamaları Özetleyecek Olursak

42. Thermal Cycler Elektroforez 3-4 hours Ürinlerin değerlendirilmesi (Agaroz jel) UV translüminatör