הבנת האפקט האנטי-ויראלי של אינטגרז אינהיביטור על HIV-1

1. הבנת האפקט האנטי-ויראלי של אינטגרז אינהיביטור על HIV-1 מגישות : אסתר שטיין מיטל שפירא בהנחיית : פרופסור אבידן נוימן ליאור שטראוס פרויקט גמר ביולוגיה חישובית, אוניברסיטת בר אילן

2. רקע – נגיף ה HIV • נגיף ממשפחת הרטרו-וירוסים, המכיל RNA. • גורם למחלת האיידס. • הנגיף מועבר במגע דם עם דם או במגע נוזלי גוף בכמויות גדולות. • תוקף את תאי הדם הלבנים של מערכת החיסון, בעיקר לימפוציטים מסוג T. • משתכפל בצורה מסיבית, התרבותו גורמת למוות של תאי T באופן ישיר וע"י תאי T ציטוטוקסיים. [1] סכמת HIV

3. רקע – מחזור התרבות ה HIV נקודות מרכזיות במחזור התרבות ה HIV : הנגיף נקשר לקולטני CD4 שעל ממברנת תאי T helper וחודר לתא (1). הוא משתמש באנזים רברס-טרנסקטיפטאז ויוצר DNAדו-גדילי (3). ה-DNA משתלב בכרומוזום התא על ידי האנזים אינטגראז (5). הנגיף מנצל את משאבי התא כדי ליצור חלבונים להרכבת נגיפים חדשים. [2] מחזור ההתרבות

4. רקע – דרכי טיפול • הגוף אינו מסוגל לחסל את וירוס בגלל 2 סיבות עיקריות :1. מתרחשות מוטציות רבות, המקשות על הנוגדנים לזהות את הפתוגן.2.הגוף לא מסוגל להתמודד עם כמות הוירוסים המסיבית המיוצרת מידי יום. • כיום ישנם מספר תרופות המאריכות את חיי החולה, אך אינן מרפאות.

5. רקע – דרכי טיפול • משתמשים בטיפול משולב -"קוקטייל" של מספר תרופות המטפלות בווירוס ב-3 רבדים. 1. מעכבי Reverse Transcriptase : מונעים שעתוק של ה-RNA הנגיפי ל-DNA(3). 2. מעכבי פרוטזות :מונע חיתוך של החלבון הראשוני המיוצר מגנום הנגיף(8). 3. מעכבי חדירה :מפריע לקשירה, איחוי וכניסהשל הנגיף לתא המארח (1). [2] מחזור ההתרבות

6. רקע – מודלים ביומתמטיים • מודל מתמטי הוא מערכת פשוטה המשתמשת במשוואות על מנת לתאר מערכת מסובכת. • מודל ביו מתמטי, מסביר תופעות ביולוגיות, כגון : דינאמיקה של טורף-נטרף, השפעת תרופה על חיידקים, התמיינות תאי מערכת החיסון ועוד. • ההבנה המולקולרית היא נקודתית ומצומצמת. • לעומתה, מודל מסביר איך השפעה נקודתית משתלבת במערכת הכללית.מודלים מתמטיים הכרחיים על מנת להבין תהליכים ביולוגיים מורכבים.

7. מטרת המחקר • האנזים אינטגראז אחראי להשתלבות הדנ"א הנגיפי בכרומוזום ההומני. • פותחה תרופה המעכבת את האנזים אינטגראז - רלטגרוויר . • מטרת המחקר היא פיתוח מודל מתמטי המדמה את התנהגות הווירוס, ברמה המערכתית, בהשפעת התרופה Raltegravir. • פיתוח המודל יעזור לנו להסיק מסקנות, שישמשו כדי ליעל את השימוש בתרופה Raltegravir ולפתח תרופות שיעבדו בשיטה זו.באמצעות המודל נוכל לנסות להבין את הדינאמיקה של הווירוס HIV, שעדיין לא פוענחה. [3] גלולות רלטגרוויר

8. מהלך העבודה • קריאת חומר תאורתי על הנגיף, התרופה ועל מודלים.

9. השפעת Raltegravir וRT-Inh על כמות הוירוס 2 פאזות RT Ral [4]

10. מהלך העבודה • קריאת חומר תאורתי על הנגיף, התרופה ועל מודלים. • יצירת סכמה המתארת את מחזור חיי הווירוס בתא.

11. מחזור חיי HIV בתא T מוות מוות וירוס HIV תא מטרה T cell ספיחה וקישור לקולטן תאי פירוק הרנ"א הויראלי Protease inh ייצור וויריונים ע"י הפרוטאז חדירה לתא והפשטה תא פעיל תא מודבק,עם RNA מוות מוות תרגום לדנ"א ע"י RT וחלבוני הנגיף RT inh Raltegravir תא מודבק,עם DNA השתלבות הדנ"א הנגיפי בדנ"א התאי ע"י אינטגראז תא מודבק,DNA משולב, לא פעיל מוות מוות

12. מהלך העבודה • קריאת חומר תאורתי על הנגיף, התרופה ועל מודלים. • יצירת סכמה המתארת את שלבי פעולת הנגיף בתוך התא. • יצירת גרפים מנתונים שלקחנו ממאמר [4].

13. השפעת Raltegravir ו RT-Inh על כמות הוירוסיצירת נתונים

14. מהלך העבודה • קריאת חומר תאורתי על הנגיף, התרופה ועל מודלים. • יצירת סכמה המתארת את שלבי פעולת הנגיף בתוך התא. • יצירת גרפים מנתונים שלקחנו ממאמר [4]. • בניית מודל מתמטי, המייצג דינאמיקה של הווירוס והתא המודבק.

15. המודל שלנו d(T)/dt = S-b*V*T+γ *Ir- δ T*T d(Ir)/dt = b*V*T-γ *Ir- δ Ir*Ir- (1- η RT ) * α IrId*Ir d(Id)/dt = (1- η RT) * α IrId * Ir- δ Id*Id-(1- η Ral) *αIdIna*Id d(Ina)/dt = (1- η Ral ) * αIdIna *Id- δ Ina*Ina- α InaIa*Ina d(Ia)/dt = α InaIa *Ina- δ Ia*Ia d(V)/dt = p*Ia-C*V S - ייצור בקצב קבוע של תאי T b - קצב הדבקה של תא T על ידי הווירוס. γ - קצב התפרקות של הרנ"א הציטופלסמטי של הווירוס. δ - קצב המוות של תאים. - α קצב מעבר בין שתי אוכלוסיות תאים. P - קצב יצירת ווירוסים על ידי תא פעיל בודד. C- קצב הפינוי של הוירוסים מהדם. η- מידת השפעת של התרופה, בין 0 (אין חסימה) ל 1(חסימה מלאה). T - תא מטרה V - וירוס Ir - תא מודבק עם רנ"א ויראלי, בציטופלזמה Id - תא מודבק עם דנ"א ויראלי Ina - תא מודבק רדום, דנ"א ויראלי משולב Ia - תא מודבק פעיל

16. מהלך העבודה • קריאת חומר תאורתי על הנגיף, התרופה ועל מודלים. • יצירת סכמה המתארת את שלבי פעולת הנגיף בתוך התא. • יצירת גרפים מנתונים שלקחנו ממאמר [4]. • בניית מודל מתמטי, המייצג דינאמיקה של הווירוס והתא המודבק. • העלאת השערות לגביי השפעת התרופה על המערכת ויצירת גרסאות מתאימות מהמודל.

17. ביצוע התאמה למשתניםParameter fitting • בדקנו את ההשערה על ידי שימוש ב Madonna. • Madonna היא תוכנה הבונה מודלים מתמטיים על ידי פתירת משוואות דיפרנציאליות. • עבור כל השערה ניסינו להתאים בין גרף הנתונים שיצרנו לבין משוואות המודל, על ידי חיפוש אחרי ערכי פרמטרים מתאימים.

18. השערה 1 • התרופה Raltegravir טובה יותר כמותית מהתרופהRT-Inh. • ייצוג במודל : ηRal > η RT

19. תוצאה 1 התאמת הפרמטים של המודל לגרף ה RTηRal = 0 η RT = 0.978 RT Ral Model קיבלנו התאמה בין גרף הנתונים של התרופה RT-Inh לגרף המודל.

20. תוצאה 1 שינינו את ערכי הη , במטרה להתאים את המודל לגרף ה RaltegravirηRal = 0.99 η RT = 0 RT Ral Model RT Ral Model לא הצלחנו לקבל התאמה קרובה מספיק על ידי שינוי ה η.

21. תוצאה 1 התאמת הפרמטים של המודל לגרף ה RalηRal = 0.9979 η RT = 0 RT Ral Model RT Ral Model קיבלנו התאמה בין גרף הנתונים של התרופה Raltegravir לגרף המודל, עם פרמטרים אחרים.

22. תוצאה 1 שינינו את ערכי הη , במטרה להתאים את המודל לגרף ה RT-InhηRal = 0 η RT = 0.994 RT Ral Model שוב, לא הצלחנו לקבל התאמה קרובה מספיק על ידי שינוי ה η.

23. מסקנות עבור מודל 1 • מודל 1 אינו מתאים לייצג את דינאמיקת הווירוס בהשפעת שתי התרופות תחת אותם אילוצי פרמטרים. • ולכן לא הצלחנו לאמת את ההשערה, כי התרופה Raltegravir טובה יותר כמותית מהתרופהRT-Inh.

24. השערה 2 • כזכור, התרופה Raltegravir מעכבת השתלבות של הדנ"א הויראלי בדנ"א ההומאני. • ההשערה היא כי המצאות ממושכת של דנ"א ויראלי שאינו משולב בדנ"א התאי, גורם לתמותה מהירה יותר של התאים הנגועים. • ייצוג במודל :הכפלת משתנה (1+ηRal)בקצב התמותה של תאי Id.

25. מודל 2 d(T)/dt=S-b*V*T+ γ *Ir- δ T*T d(Ir)/dt= b*V*T- γ *Ir- δ Ir*Ir -(1- η RT ) * α IrId*Ir d(Id)/dt=(1- η RT) * α IrId* Ir - δ Id*Id*(1+ηRal) - (1- η Ral )*α IdIna*Id d(Ina)/dt =(1- η Ral) * α IdIna*Id- δ Ina*Ina - α InaIa*Ina d(Ia)/dt = α InaIa*Ina- δ Ia*Ia d(V)/dt= p*Ia-C*V S - ייצור בקצב קבוע של תאי T b - קצב הדבקה של תא T על ידי הווירוס. γ - קצב התפרקות של הרנ"א הציטופלסמטי של הווירוס. δ - קצב המוות של תאים. - α קצב מעבר בין שתי אוכלוסיות תאים. P - קצב יצירת ווירוסים על ידי תא פעיל בודד. C- קצב הפינוי של הוירוסים מהדם. η- מידת השפעת של התרופה, בין 0 (אין חסימה) ל 1(חסימה מלאה). T - תא מטרה V - וירוס Ir - תא מודבק עם רנ"א ויראלי, בציטופלזמה Id - תא מודבק עם דנ"א ויראלי Ina - תא מודבק רדום, דנ"א ויראלי בגרעין Ia - תא מודבק פעיל

26. תוצאה 2 התאמת הפרמטים של המודל לגרף ה RalηRal = 0.9949 η RT = 0 RT Ral Model קיבלנו התאמה בין גרף הנתונים של התרופה Ral לגרף המודל.

27. תוצאה 2 שינינו את ערכי הη , במטרה להתאים את המודל לגרף הRTηRal = 0 η RT = 0.9956 RT Ral Model – Ral Model - RT לא הצלחנו לקבל התאמה גבוהה של Ral לגרף המודל.

28. תוצאה 2 התאמת הפרמטים של המודל לגרף ה RTηRal = 0 η RT = 0.978 RT Ral Model קיבלנו התאמה בין גרף הנתונים של התרופה RT-Inh לגרף המודל.

29. תוצאה 2 שינינו את ערכי הη , במטרה להתאים את המודל לגרף ה RaltegravirηRal = 0.978 η RT = 0 RT Ral Model – RT Model - Ral לא הצלחנו לקבל התאמה גבוהה לגרף ה Ral

30. תוצאה 2 חיפשנו התאמה טובה יותר של ערכי הη , עבור גרף ה RaltegravirηRal = 0.981 η RT = 0 RT Ral Model – RT Model – Ral 0.978 Model – Ral 0.981 Ral יוצר שיפוע חד יותר מ RT

31. ניתוח תוצאות מודל 2 • מודל 2 אינו מתאים לייצג את דינאמיקת הווירוס בהשפעת שתי התרופות תחת אותם אילוצי פרמטרים. • לא ניתן לאמת את ההשערה, כי המצאות ממושכת של דנ"א ויראלי שאינו משולב בדנ"א התאי, מגביר את קצב התמותה של התא. • עם זאת, רואים כי יש ירידה חדה יותר בכמות הווירוס תחת השפעת התרופה Raltegravir.

32. השערה 3 • לאחר ההדבקה של תאי T helper על ידי הווירוס, אוכלוסיית תאי ה T helper מתפצלת לשתי תת אוכלוסיות, בעלי התנהגות שונה. • התרופה Raltegravir משפיעה על שתי האוכלוסיות בצורה דומה, אך התרופה RT-Inh משפיעה פחות על אחת מהאוכלוסיות.

33. מודל 3 d(T)/dt= S-b*Vtot*T+ γ x*Irx+ γ y*Iry - δ T*T פיצול ל-2 תתי אוכלוסיות x,y : d(Irx)/dt= b*Vtot*T*pre- γ x*Irx- δ Irx*Irx- (1- η RTx ) * α IrIdx*Irx d(Idx)/dt= (1- η RTx ) * α IrIdx * Irx- δ Idx*Idx-(1- η Ralx ) * α IdInax*Idx d(Inax)/dt = (1- η Ralx ) * α IdInax *Idx- δ Inax*Inax- α InaIax*Inax d(Iax)/dt = α InaIax *Inax- δ Iax*Iax d(Vx)/dt= px*Iax-C*Vx S - ייצור בקצב קבוע של תאי T b - קצב הדבקה של תא T על ידי הווירוס. γ - קצב התפרקות של הרנ"א הציטופלסמטי של הווירוס. δ - קצב המוות של תאים. - α קצב מעבר בין שתי אוכלוסיות תאים. P - קצב יצירת ווירוסים על ידי תא פעיל בודד. C- קצב הפינוי של הוירוסים מהדם. η- מידת השפעת של התרופה, בין 0 (אין חסימה) ל 1(חסימה מלאה). T - תא מטרה V - וירוס Ir - תא מודבק עם רנ"א ויראלי, בציטופלזמה Id - תא מודבק עם דנ"א ויראלי Ina - תא מודבק רדום, דנ"א ויראלי משולב Ia - תא מודבק פעיל Pre - אחוז התאים השייכים לתת אוכלוסיה x

34. תוצאה 3 התאמת הפרמטים של המודל לגרף ה RT (ηRal = 0)ηRT x = 0.47 η RT y = 0.993 RT Ral Model קיבלנו התאמה בין גרף הנתונים של התרופה RT-Inh לגרף המודל.

35. תוצאה 3 שינינו את ערכי הη , במטרה להתאים את המודל לגרף ה Raltegravir (η RT = 0)ηRal x = 0.99 ηRal y = 0.992 RT Ral Model לא הצלחנו לקבל התאמה קרובה מספיק על ידי שינוי ה η.

36. תוצאה 3 התאמת הפרמטים של המודל לגרף ה Ral(η RT = 0)ηRal x = 0.65 ηRal y = 0.9965 RT Ral Model קיבלנו התאמה בין גרף הנתונים של התרופה Raltegravir לגרף המודל, עם פרמטרים אחרים.

37. תוצאה 3 שינינו את ערכי הη , במטרה להתאים את המודל לגרף הRT (ηRal = 0)η RT x = 0.1 ηRT y = 0.995 RT Ral Model הצלחנו לקבל התאמה קרובה מספיק על ידי שינוי ה η. 

38. ניתוח תוצאות מודל 3 על פי ההשערה, התרופה Raltegravir משפיעה על שתי תתי האוכלוסיות, בעוד התרופה RT-Inh מצליחה להשפיע על תת האוכלוסיה Y בלבד. לפי התאמת הפרמטרים המוצלחת : • אוכלוסיית תאי המטרה שהודבקו מתפלגת ל 2 -Y - 96%X - 4% • תת אוכלוסיה X מתה לאט כאשר הווירוס בתאים במצב פעיל, כלומר - מערכת החיסון פועלת על אוכלוסיה זו יותר לאט. • המעברים כולם איטיים יותר, במיוחד המעבר מדנ"א ויראלי חופשי בתא לדנ"א המשולב בדנ"א ההומאני.התרופה Raltegravir פועלת בדיוק בשלב זה. מכאן נובעת הצלחת היתרה של התרופה Raltegravir,לעומת RT-Inh.

39. מסקנות עבור מודל 3 • מודל 3 מציע הסבר אפשרי לייצוג דינאמיקת הווירוס בהשפעת כל אחת מהתרופות, תחת אותם אילוצי פרמטרים. • כלומר – ייתכן בסבירות גבוהה כי קיימות 2 תתי אוכלוסיות המושפעות באופן שונה מכל אחת מהתרופות.

40. מסקנות • בכל הגרפים שבנינו על סמך המודלים, ראינו שהתרופה Raltegravir מורידה בצורה חדה יותר את כמות הווירוסים, בפאזה הראשונה. גם במודלים 1 ו 2 בהם לא הגענו להתאמות מלאות. • מודל 3, בו הצלחנו להגיע להתאמה, מצביע על האפשרות כי קיימות תתי אוכלוסיות של תאים מודבקים בעלות התנהגות שונה ותגובה אחרת לכל תרופה. • ייתכן כי ההשערות הינן נכונות, למרות שלא הצלחנו לאמת אותן, כי קיימים גורמים נוספים הפועלים במערכת.

41. סיכום • מטרה : הבנת התנהגות הווירוס תחת התרופה Raltegravir. • אמצעי : מודלים ביו מתמטיים. • השערות ותוצאות : השערה 1– התרופה Raltegravir טובה יותר מהתרופה RT-Inh. השערה 2 –דנ"א וויראלי שאינו משולב מהר בדנ"א התאי גורם לתמותה מהירה. השערה 3 – קיימות תתי אוכלוסיות עם התנהגות שונה, התרופה RT-Inh לא מצליחה להגיע לאחת מהן. • מסקנות : הגורמים בהם עסקנו יכולים להיות רלוונטים כחלק מהסבר להתנהגות הווירוס. 

42. כיווני מחקר אפשריים • בדיקה איך תא מגיב לכמות גדולה של דנ"א ויראלי שאינו משולב בדנ"א התאי. • שימוש בכלים מתמטיים מתקדמים יותר, יכול להוביל להתאמות טובות יותר. • ביצוע התאמה עם נתונים שהתקבלו מניסויים שבוצעו. • מעקב אחר תאי CD4 בעקבות טיפול בתרופה. • נסיון טיפול המשלב את 2 התרופות.

43. תודות • פרופסור אבידן נוימן. • ליאור שטראוס. • ד"ר רחל דרומר. • יונית הומבורגר.

44. ביבליוגרפיה [1] wikipedia, HIV, http://he.wikipedia.org/wiki/HIV [2] מצגות מהקורס "מבוא לוירולוגיה", ד"ר רונית שריד [3] wikipedia, Raltegravir, http://en.wikipedia.org/wiki/Raltegravir [4] Murray JM, Emery S, Kelleher AD, et al. (2007) Antiretroviral therapy with the integrase inhibitor raltegravir alters decay kinetics of HIV, significantly reducing the second phase, AIDS, 21 : 2315-2321