实验十免疫细胞化学染色观察肿瘤细胞蛋白的表达与分布

实验十 免疫细胞化学染色观察肿瘤细胞蛋白的表达与分布

实验目的与要求 • 掌握免疫细胞化学技术的基本原理; • 了解免疫细胞化学技术在肿瘤病理 • 学等学科领域的广泛应用.

一、实验基本原理 • 抗原的概念 • 一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与效应的免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质，也称为免疫原。 • 前一种性能称为免疫原性或抗原性，后一种性能称为反应原性或免疫反应性。

抗体的概念 • 环境中的大部分生物（包括病原生物）及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外原抗原，这些抗原能通过侵染和其它的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。 • 同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清。 • 因血清抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的抗体，称为多克隆抗体。 • 一个B细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。

抗原抗体反应 抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，这种特性就是许多免疫检测方法的基础。

二、试剂与器材 人肿瘤细胞涂片甲醇、H2O2、滤纸、PBS、正常羊血清封闭液、一抗、生物素化二抗、亲和素―生物素化过氧化物酶、 DAB显色液、 DDW、甘油/PBS封片剂、盖玻片普通光学显微镜

三、实验步骤 • 玻片细胞置于甲醇中-10℃固定5min，室温凉干（或冷 • 丙酮固定5min，室温凉干）； • PBS漂洗2min×3次； • 3% H2O2室温孵育10min（以去除细胞内源性过氧化物 • 酶活性）； • PBS漂洗5min×3次； • 10%正常羊血清封闭液（0.1M PBS配制）室温封闭20min；弃封闭液（此步骤不必PBS洗涤）； • 用适当比例稀释的一抗（一般稀释比为1:100-1:200）37℃ • 孵育1h（或4℃孵育过夜）； • PBS漂洗5min×3次；

用适当比例稀释的生物素化二抗（一般稀释比例约1:100-1:200）37℃孵育10-15min；PBS漂洗5min×3次；亲和素―生物素化过氧化物酶（avidin biotinylated HRP）37℃孵育10-15min；PBS漂洗5min×3次；过氧化物酶底物作用液（即DAB显色液，按试剂盒说明进行配制）室温孵育2－10min（显色至得到合适显色反应即可终止）；自来水中止显色反应，自来水洗涤，DDW漂洗1min×2次，封片后显微镜观察。

四、注意事项 • DAB是可疑致癌物, 使用时要小心; • DAB显色时要避光进行, 注意显色时间; • 各漂洗步骤要充分; • 注意各级抗体的使用浓度及孵育时间.

五、作业与思考题 试述免疫细胞化学反应的基本原理,并描述实验中所观察到的实验现象,并给予解释.

实验十 免疫细胞化学染色观察肿瘤细胞蛋白的表达与分布