Curso de Bioquímica Vegetal Avanzado

1. Curso de Bioquímica Vegetal Avanzado Seminario 2 “Efecto de la toxicidad del cadmio en el metabolismo del Nitrógeno en las hojas de la Solanum nigrum L. como un hiperacumulador de cadmio recientemente encontrado” Equipo 4 Darlin Quintero González Mayelín Rosquete Bassó Miguel Vasallo Hernández

2. Introducción El cadmio es considerado como un metal pesado tóxico perjudicial para los humanos, demás animales y plantas por lo cual es importante mantenerlos en bajas concentraciones en los suelos. Existen plantas como la Solanum nigrum L. consideradas hiperacumuladoras de metales pesados y especialmente del cadmio, este metal es capaz de intervenir en la acción de varias enzimas relacionadas con el metabolismo del Nitrógeno las cuales son esenciales para la localización de recursos, el crecimiento y desarrollo del la planta.

3. Desde la década de los 90 las plantas hiperacumuladoras han sido estudiadas por la alta tolerancia que presentan hacia los metales pesados, estas desarrollan mecanismos de tolerancia y acumulación de los mismos, lo cual representa una vía para la eliminación de estos metales de ecosistemas dañados. • Estudios realizados por Hsu et al; 2006 demuestran que el cadmio afecta el metabolismo de varias tipos de plantas. • La planta S.nigrum fue reportada por Wei et al; 2005 comoun nuevo hiperacumulador de Cadmio. • También ha sido reportado que algunas plantas presentan tolerancia al estrés provocado por el cadmio manteniendo normal el metabolismo del nitrógeno.(Gussardon et al; 1996). Escuela encargada del trabajo científico: Estación Experimental de Ecología en Shenyang. Academia de Ciencias Chinas. 2008

4. Objetivo: Evaluar los efectos del cadmio en los indicadores del metabolismo del nitrógeno, investigando los cambios en las concentraciones de la formas del mismo y los cambios en la actividad de las enzimas que intervienen en el mismo, en las hojas del hiperacumulador de cadmio S. nigrum durante diferentes estados del crecimiento.

5. Materiales y Métodos • Estado Inicial: Las muestras se toman del horizonte A del suelo (0-20 cm); con un contenido de MO de 1,52%; N total 0,11% , pH de 6,5 y concentración de Cd de 0,20 mg/Kg. • Preparación de suelo y atención cultural a la planta • Se le adiciona NH4NO3 y K2HPO4 (100 mg de N/Kg, 30 mg de P/Kg y 80mg de K/Kg ). • Se toman cuatro tratamientos (T1-T4) y un control (CK) de concentraciones: 6,12, 24, 48 mg de Cd/ Kg en peso seco de suelo preparados de una disolución de CdCl2*2.5 H2O. • Las semillas son esterilizadas con solución de peróxido de hidrógeno. • Medición del crecimiento • Se realiza un análisis fisiológico en las plantas. (determinación de DW y FW en diferentes partes de la planta) • Determinación del Cd • Se realiza la digestión de la planta utilizando HNO3/HClO4 se determina la concentración del Cd por AA.

6. Materiales y Métodos (Cont.) Determinación de N total. El N total fue determinado por el método de Kjeldahl utilizando soluciones de H2SO4, K2SO4 y CuSO4 para la digestión. El amonio fue destilado en solución alcalina y determinado colorimétricamente utilizando una solución de H2SO4 (0,020 M) Determinación de Nitrato y amonio Las concentraciones de amonio y nitrato se analizaron utilizando un Analizador de Flujo Continuo. El nitrato fue determinado por reducción del nitrato a nitrito y por determinación colorimétrica por reacción de diazotación. El amonio fue determinado por el método de Berthelot modificado.

7. Materiales y Métodos (Cont.) Ensayos de enzimas y proteínas Actividad de la Nitratorreductasa (NR) La actividad de la NR en las hojas fue extraída y medida “in vitro” por el método de Aslam et al; (1984) con algunas modificaciones. Una vez obtenida la disolución final se mide la absorbancia a 540 nm y la actividad de esta enzima es definida como µg NO2- por hora. Actividad de la glutamatosintasa (GS) En la extracción de la GS se utiliza el método de Oaks et al; (1980). La absorbancia de la solución final se mide a 540nm; expresándose la actividad de esta enzima en µg de -glutamilhidroxamato formado por minutos. Actividad de la glutamatodeshidrogenasa (GDH) La actividad de la esta enzima fue determinada como actividad de la NADH-GDH aminando directamente, midiendo espectrofotométricamente el consumo de NADH a 340nm; la actividad de la GDH se expresa en µmol NADH oxidado por minuto. Las proteínas solubles fueron determinadas utilizando el extracto crudo de enzimas de GDH por el método de Bradford (1986).

8. Resultados y Discusión • En los dos estados del crecimiento los valores no presentan diferencias estadísticas excepto en los tratamientos T3 y T4. • Marcadamente en la germinación donde la diferencia resulta de un 55.1% en ramas y un 57.1% en las raíces con respecto al control.

9. Resultados y Discusión Se aprecia como el crecimiento de la S. nigrum no se inhibe significativamente para concentraciones menores de 24mg/Kg

10. Resultados y Discusión

11. La actividad de las enzimas NR y GS se inhiben significativamenteen los tres estados del crecimiento. • La actividad de la GDH se incrementa progresivamente constituyendo otra vía de asimilación del NH4+

12. Resultados y Discusión • El estudio muestra que hasta concentraciones menores de 12mg/Kg de Cd la planta S.nigrum no presenta afectaciones y se mantiene normal el metabolismo del nitrógeno. • El cadmio reduce la concentración de nitrato en las hojas y disminuye marcadamente la actividad de la NR en todos los estados del crecimiento. • Se inhibe la acción da la GS pero consecuentemente aumenta la actividad de la GDH.

13. Conclusiones • Durante el período de crecimiento de la S.nigrum a concentraciones de cadmio menores de 24mg/Kg no se ve afectada esta planta hiperacumuladora. • El metabolismo del N no se ve afectado a valores menores o iguales a 12mg/Kg. • La disminución de las concentraciones de nitrato y el aumenta de las concentraciones de amonio así como la disminución de las actividades de las enzimas GS y NR, y el aumento de la GDH se manifiesta significativamente a concentraciones de Cd mayores a 48mg/Kg.