Download
1 / 59
590 likes | 689 Vues
生物芯片的制备技术研究. 余 志 文. 导师： 于 军 教授、博导. 华 中 科 技 大 学 电子科学与技术系微电子所 2001 年 5 月 8 日. 生物芯片的制备技术研究. 第一章 绪 论. 第二章 生物芯片的基本原理. 第三章 基因芯片的制备与检测技术研究. 第四章 肝炎诊断基因芯片的制备及性能分析. 第五章 蛋白质芯片的构建及性能研究. 第六章 生物芯片实用化的若干问题. 第七章 总 结. 一、 绪 论. 生物芯片将象计算机芯片一样成为新世纪即将来临的又一次高新科技革命的奠基石. 生物芯片诞生的划时代意义. 生物芯片研究的国内外概况.
E N D
生物芯片的制备技术研究 余 志 文 导师：于 军 教授、博导 华 中 科 技 大 学 电子科学与技术系微电子所 2001年5月8日
生物芯片的制备技术研究 第一章 绪 论 第二章 生物芯片的基本原理 第三章 基因芯片的制备与检测技术研究 第四章 肝炎诊断基因芯片的制备及性能分析 第五章 蛋白质芯片的构建及性能研究 第六章 生物芯片实用化的若干问题 第七章 总 结
一、 绪 论 生物芯片将象计算机芯片一样成为新世纪即将来临的又一次高新科技革命的奠基石 生物芯片诞生的划时代意义 生物芯片研究的国内外概况 生物芯片的应用领域 课题来源和研究意义
生物芯片诞生的划时代意义 计算机芯片给人类带来的冲击 生物芯片给医学和生命科学带来的革命 微处理器使我们的经济发生了根本改变、给人类带来了巨大的财富、改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大，它可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世界的面貌。
生物芯片研究的国内外概况 Affymetrix开发多种基因芯片(HIV,p53,p450 等等) Hyseq开发的薄膜测序芯片（标记的探针为已知序列） Synteni(Incyte) 两种荧光标记，mRNA表达情况 Nanogen主动式电子生物芯片，检测速度更快 Agilent(HP) CMS(Motorola)的eSensorTM利用杂交电信号检测 Stanford、Pennsylvania、MIT等国外大学和研究机构
生物芯片研究的国内外概况 清华大学、东南大学、 上海细胞所与陕西超群公司 第四军医大与陕西高科集团 联合基因科技公司与第一军医大 复旦大学、军事医学科学院、 北京博奥 台湾、香港（HKtU、HKcityU,中药筛选、白血病、肿瘤)
生物芯片应用领域 基因测序(gene sequencing)、基因表达(gene expression)分析 疾病诊断与治疗 中药成分的真伪鉴定、超高量筛选、新药的开发 环境保护、食品卫生监测、生物武器和化学武器战争 司法与法学 农林业方面与农作物的品质相关的育种改良 分子生物学、航空航天……
课题来源和研究意义 武汉市重点科技攻关项目“传染性疾病诊断与分析生物芯片的研究” —基因芯片的工作原理、芯片组成和结构的基本理论； —基因芯片的制备和检测技术 —蛋白质芯片的技术平台和蛋白质芯片的初步构建 —生物芯片实用化和市场前景分析
课题来源和研究意义 .大大推进基因组研究， .为研究不同层次多基因协同作用的生命过程提供手段。 .利用基因芯片技术，可以寻找基因与疾病的相关性， 进而开发相应的药物和治疗技术 .可以实现对待测基因群和相关疾病的快速、准确和简便的诊断 .广泛的应用领域，潜在的市场前景，必将带来巨大的经济效益 .为开发有自主知识产权的生物芯片设计和制备关键技术
二、 生物芯片的基本原理 生物芯片的基本概念 生物芯片的分类 几种生物芯片的有关进展
生物芯片的基本概念 运用大规模集成电路的光刻技术以及生物分子的自组装技术，在一微小芯片上组装成千上万个不同生物分子（DNA，蛋白质，多肽，细胞等）微阵列，然后与扩增和标记过的生物样品分子进行杂交和反应，通过对每个探针分子的杂交信号进行检测和分析，从而实现对生物分子信息的快速、并行、大规模检测
生物芯片的分类 一般分为基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室三大类 而现在很多都是按其功能分，有以下常用芯片：样品制备芯片、PCR芯片、毛细管电泳芯片、生物电子芯片、药物筛选芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、疾病诊断芯片（肝炎芯片Hepatitis Chip、白血病芯片Leukemia Chip、肺结核芯片TB chip等）、血气检测芯片、多糖芯片、神经元芯片、芯片实验室等。
几种生物芯片的有关进展 1、样品制备芯片(sample preparation chip) 2、PCR芯片(PCR chip) 3、检测芯片 ① 毛细管电泳芯片(CE chip) ② DNA突变检测芯片(mutation study chip) ③ 基因表达分析芯片(gene expression analysis chip) ④ DNA测序芯片(sequencing chip) 4、蛋白质芯片(protein chip) 5、生物电子芯片(bioelectronic chip) 6、药物筛选芯片(drug screening chip) 7、芯片实验室(lab-on-chip)
三、基因芯片的制备与检测技术研究 基因芯片概述 基因芯片微阵列的构建 样品制备与杂交反应 信号检测及分析
基因芯片概述 基因是遗传的生物学单位，所谓基因是带有遗传性状的DNA片段，每个基因具有自身的遗传密码。基因中的错误将导致疾病产生 。 DNA链由两条碱基互补的脱氧核苷酸链反向平行旋转形成双螺旋结构。每个脱氧核苷酸由一个碱基、一个脱氧核糖及一个磷酸分子组成。DNA中的碱基种类有四种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）。碱基的不同决定了脱氧核苷酸种类的不同。生物的遗传信息就编码存储于这些核苷酸的排列顺序之中。
基因芯片概述 基因芯片的出现使信息存储和处理进入生命信息的新领域 基因芯片是现代微电子技术与生物技术融合的产物，它的基本原理是采用微电子加工技术以及基因分子的自组装技术，将大量DNA片断有序地固化在支持物表面，然后与扩增和标记过的生物样品进行充分杂交，再加以洗脱后，通过对每个探针分子的杂交信号进行检测分析，进而获取样品分子的生物遗传信息
基因芯片图解 特征DNA链 变性，断链 加入样品，杂交
基因芯 片图解 检测分析 探针与样品杂交
基因芯片微阵列的构建 支持物的选择与处理： 玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维膜、尼龙膜、陶瓷片等等支持物 玻片的优点：DNA样品可共价结合；可耐受高温和高离子强度；不可浸润性，使杂交体积降低到最小；本底低，不会造成很强的背景干扰；可使用双荧光甚至多荧光杂交系统 ，同时对两个以上的样本进行平行处理 ；光刻的方法在玻璃芯片上刻出微流路或微孔等 。 原位合成的支持物在聚合反应之前一般要先使其表面衍生出羟基或氨基，并与光敏材料的光敏保护基团形成共价交联而被保护起来； 而作点样用的支持物一般要使其表面带上正电荷以吸附带负电的DNA探针，通常是采取包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸的方法来实现 。
基因芯片微阵列的构建 探针制备及固化： 原位合成法 （光刻原位合成Affymetrix，分子印章原位合成东南大学等） 合成点样法 （点接触法，喷墨法等） 用紫外线对其交联固化
样品制备与杂交反应 从血液或活组织细胞中获取的DNA/mRNA样品，扩增以提高阅读的灵敏度 PCR扩增、大规模平行固相克隆、 标记：荧光素、生物素、同位素 杂交：是指一条DNA分子单链与另一条不同来源的单链结合的反应。但这又不仅仅是一个简单的按碱基配对的原则形成双链的反应。影响杂交反应的因素有很多，包括靶片断浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度以及温度等等。
信号检测及分析 荧光标记的杂交信号检测方法 激光扫描荧光显微镜、激光扫描共焦显微镜、采用CCD相机的荧光显微镜、光纤传感器 生物素标记的杂交信号探测方法 荧光素结合物、化学发光底物酶结合物、光散射法
信号检测及分析 通过扫描采集到杂交信号图象后，要经过专门的软件进行处理，并从中提取杂交点的光强度信号进行定量分析、处理，通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类，最终整合杂交点的生物学信息，从而发现待测样品的遗传信息。 当前在信号的获取与分析上，多数方法使用荧光法进行检测和分析，重复性较好，但灵敏度不高，且背景干扰因素较多。另外还有质谱法、化学发光法、光导纤维法及生物传感器法等。越来越多的研究者正在研究更新、更灵敏、更便捷的检测方法。
信号检测及分析 Motorola旗下的CMS公司研究的利用循环探针技术的生物电子学检测（也叫电化学检测方法），其原理是利用DNA/RNA的互补结合特性装配一个电子电路单元，从而当目标DNA/RNA被捕获时，产生一个可探测的电信号 Northwestern University的研究人员结合金乳酸和DNA制成能检测DNA的微小探针的新方法，一台简单的平台扫描仪能用来显示灰点的完全匹配的配对物的幻灯片，这点越黑，表明靶DNA出现的越多。能够区分完全匹配互补的DNA链和仅相差一个碱基对的几乎完全匹配的链，荧光检测根本不能做到这一点。
四、肝炎诊断基因芯片的制备及性能研究 前期研究与实验 肝炎诊断基因芯片的制备与应用实验 基因芯片实验中的常见问题
前期研究与实验 芯片版图设计与制备 图4.1 金电极微流路图 （版图尺寸20×20mm2） 图4.2 探针点阵与测试电极图 （版图尺寸20×20mm2）
前期研究与实验 金膜探针固定点 杂交信号导出点 探针阵列 金电极微流路 图4.3 微流路版图局部示意图 图4.4 微探针点阵局部示意图 光刻版图、微流路和探针点阵局部图
前期研究与实验 Si3N4 SiO2 Au 80μm 150μm Si G T T A C G . . G A C 图4.6 探针示意图 图4.5 单个点阵局部示意图 金电极微阵列导出杂交后电信号的变化， 从而检测和分析样品上的遗传信息
前期研究与实验 前期预实验 利用微电子刻蚀技术在玻片上刻蚀出微孔点阵，然后用粘附剂处理玻片，再在微孔中进行一抗二抗特异性反应，二抗上带有荧光素标记，再检测反应结果。从而模拟基因芯片探针的点样和杂交反应中的特异性结合。
肝炎诊断基因芯片的制备与应用实验 传统检测方法的检测对象为蛋白质，利用ELISA的方法操作较繁琐、灵敏度较低，而且与每个人的免疫应答能力有关；诊断芯片的检测对象是基因，利用其碱基互补机制，样品用量少、准确性高，且能比传统方法更早地做出诊断。
肝炎诊断基因芯片的制备与应用实验 探针DNA的准备 目的DNA的选择（HAV、HBV、HCV、HDV特异性DNA片断） PCR扩增 点样以前，要将PCR产物清洗纯化干净，并且对DNA进行一些处理，一般用异丙醇沉淀PCR产物，以除去酶、离子及核苷酸等。 载物片的选择与处理 载物片是要将DNA点上去的支撑物，可用作基因芯片基底材料有硅片、玻片、硝酸纤维膜、陶瓷片、尼龙膜等，一般被动式生物芯片常用载玻片。DNA并不能直接固定在玻璃表面，因此需要对玻璃表面进行处理。
肝炎诊断基因芯片的制备与应用实验 点样 点样设备为美国CARTESIAN TECHNOLOGIES 制造的ProSysTM PA Workstation全自动针阵点样系统，高精度X-Y-Z样品平台，移动精度达到10微米 点样的质量主要表现在点与点的距离，这取决于点样吸头的尖锐度与多聚-L-赖氨酸涂面的疏水性 点样后加工处理 当一个基因芯片点成之后，需要对其进行进一步的加工处理，以便能够用于以后的杂交实验。通常进行四步处理，即重新水合化及快速干燥、UV-交联、封闭和变性
肝炎诊断基因芯片的制备与应用实验 待测样品制备、标记 和实验对照设计 从样品中提取RNA（或cDNA）、在PCR扩增的时候加上标记 异种RNA平行实验 RNA质量检测对照 封闭对照 归整化对照 杂交和杂交后处理 注意杂交的温度和湿度、清洗
肝炎诊断基因芯片的制备与应用实验 荧光扫描分析 美国GSI Lumonics公司出品新一代激光共聚焦生物芯片扫描系统ScanArray 4000 、一套系统，包括配套分析处理图象软件
肝炎诊断基因芯片的制备与应用实验 传统ELISA PCR+ ELISA 基因芯片 检测对象 蛋白 基因 基因 免疫反应 需免疫应答反应 无需 无需 检测品种 单一检测 单一检测 同时多项检测 检测原理 抗原-抗体反应 PCR+杂交+抗原-抗体反应 杂交(或加PCR) 检测效果 有一定漏检率 准确、可靠 准确、可靠、灵敏 检测特点 显色反应 操作复杂 显色反应 操作更复杂 由荧光扫描仪检测 计算机自动分析 成 本 中 高 低 传统检测方法与基因芯片检测方法比较 方法 项目
基因芯片实验中的常见问题 点印点的形态不规则（拖尾 、小空洞） 强背景信号（导致图像模糊不清） 局部信号偏弱
五、蛋白质芯片的构建及性能研究 基因芯片只能检测到人体各种遗传信息在DNA/RNA水平的变化，而无法检测出在蛋白质水平上的变化。同时基因芯片的制作和检测费时，所需探针必须人工合成，必须经PCR扩增过程，还要进行昂贵的荧光标记。随着人类基因组计划测序工作的完成，下一步将要进入更加复杂的蛋白质功能的研究，迫切需要蛋白质芯片技术 。 蛋白质芯片概述 蛋白质芯片构建的技术平台研究 蛋白质芯片的初步构建 在疾病诊断中蛋白质芯片和DNA芯片的比较
蛋白质芯片概述 在DNA上的遗传信息绝大部分编码的是蛋白质的氨基酸排列顺序，它们最终需要表达成蛋白质才能起作用。蛋白质是生物表现千差万别的功能的基本物质。 基因组序列的信息是由蛋白表达才行使其功能的，进而使生命能够正常进行。 蛋白质芯片是利用抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。
蛋白质芯片概述 蛋白质芯片构建的简化模型为：选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子（抗原或抗体），这样形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。如果加入与之特异性反应的带有特殊标记的蛋白质分子（抗体或抗原），两者结合后，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检，即蛋白质的检测。 蛋白质芯片以蛋白质代替DNA作为检测目的物，比基因芯片更进一步的接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。
蛋白质芯片构建的技术平台研究 蛋白质方阵要解决的问题： 一是要保持蛋白的活性(点样溶液中加入40%甘油以防止蛋白变性) 二是要保证蛋白质正确定位(在膜表面覆盖一层与氨基反应的试剂，蛋白质的氨基末端或赖氨酸残基就会与此试剂交联反应而固定于膜上。每个位点中蛋白质都会以多种不同的取向定位于膜上，保证了正确的定位，保证了靶分子结合的有效性) 三是要与现存的mRNA微型方阵研究工具要相兼容(荧光标记蛋白，ATP标记的激酶底物，用BSA进行封闭，降低膜上的背景，这样就可以与蛋白质进行杂交)
蛋白质芯片构建的技术平台研究 构象性蛋白质芯片： 模板印迹的纳米级结构表面技术可以将蛋白质特异识别应用于蛋白质芯片制造 1. 表面印记法 2. 三维构象的芯片表面蚀刻微处理技术 构象性蛋白质芯片将在另一个层面上融合纳米技术、半导体技术、计算机技术和分子生物学技术
蛋白质芯片构建的技术平台研究 检测分析： 1、原子力显微镜表面扫描技术 2、Bioacore为代表的生物传感技术 3、表面增强激光解吸附/离子化技术 （SELDI技术， Ciphergen Biosystem Ltd.) 也许最有前途
蛋白质芯片的初步构建 构建蛋白质芯片的载体比较 普通玻片，氨基修饰的玻片，醛基修饰的玻片，聚赖氨酸修饰的玻片，聚苯乙烯板（酶标板），醋酸纤维薄膜（NC纸），特殊处理的聚偏二乙烯二氟PVDF滤纸（95%酒精浸泡，蒸馏水洗涤，烘干，备用）等7种材料 图5.1 PVDF与NC固定效果比较 左为PVDF 右为NC
蛋白质芯片的初步构建 蛋白质芯片对不同来源的抗原的检测 图5.2 抗原为碱性蛋白酶 图5.3 抗原为乙肝表面抗原
蛋白质芯片的初步构建 蛋白质芯片对混合抗原抗体的检测 图5.4 混和抗原抗体
蛋白质芯片的初步构建 蛋白质芯片检测的灵敏度 图5.4 检测的灵敏度
在疾病诊断中蛋白质芯片与DNA芯片的比较 运用基因芯片来进行检测的，是通过对人体中是否带有病毒粒子的DNA或RNA来进行判断 合成大量各型肝炎的特异性单链片段 （探针）→ 固定（芯片） 待测血清提取RNA片断 → PCR扩增 → 荧光标记 → 杂交 哪一种肝炎探针位置处检测出荧光，于是断定患者患有该种肝炎 利用基因芯片来检测，操作复杂，须查阅资料人工合成探针，须经PCR扩增，荧光标记昂贵，试剂材料损耗量大，耗费大量人工与时间
在疾病诊断中蛋白质芯片与DNA芯片的比较 蛋白质芯片利用抗原抗体的特异性结合反应， 将各型肝炎的抗体分别固定于载体上，制成肝炎检测蛋白质芯片。 只需患者的血清，将芯片置于血清中反应1小时后，再加入酶标二抗，反应显色，如血清中含有抗原，即血请中有某一型肝炎病毒，通过对酶标二抗的检测，就能很快得到结果。整个过程所需时间较短，操作并不复杂，所需材料用量较少。 基因表达水平上的检测，有致病基因并不表示会得病，只有当致病基因表达出蛋白质后，才表现为疾病。 基因芯片进行前期诊断和检测，和健康普查，就可以提早发现基因变异和致病基因
六、生物芯片实用化的若干问题及其应用前景分析六、生物芯片实用化的若干问题及其应用前景分析 生物芯片实用化的若干关键问题 生物芯片的应用前景分析 生物芯片技术的发展方向
生物芯片实用化的若干关键问题 1. 资源缺乏 等米下锅 2. 相关研究和技术有待提升 3. 基因专利的限制 4. 造价居高不下，难以市场推广 5. 急需投资基金的注入 6. 平衡发展，寻求突破
