标记免疫技术

1. 标记免疫技术 微生物与免疫教研室

2. 实验六 乙肝两对半的检测及临床意义 —ELISA和ICA的比较

3. 一、目的要求 1. 熟练掌握免疫酶标记技术。 2. 掌握乳胶标记技术。 3. 掌握乙肝两对半ELISA和ICA检测的原理和实验方法。 4. 掌握乙肝两对半检测的临床意义。 5. 比较ELISA和ICA的优缺点。

4. 乙肝相关知识 • 慢性乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的慢性、传染性疾病，严重危害健康，影响生活质量。 • 1.乙肝的流行病学 全世界半数以上的人被感染过，5％为慢性感染，每年有5000万新感染，100万死亡。我国有9.8％HBsAg（＋），慢性达1000万，60％人群感染。

5. 2.传播途径 • 传染源：HBV携带者、乙肝患者血液、体液（精液、阴道分泌物、唾液） • 传播途径：血液、血制品、性、垂直、日常密切接触 • 易感人群：母亲是HBV感染的婴儿、HBV感染家庭成员、吸毒者、性病病人、血透病人、部分医护人员

6. 3.乙肝病毒的形态结构、基因组的特点 • HBV颗粒：小球形颗粒（无病毒核酸，无感染性）——病毒颗粒包膜产生过剩 • 管形颗粒（小球颗粒连接而成） • Dane颗粒（具有感染性的完整颗粒） • 基因：已知DNA病毒中颗粒最小的，带有部分单链区的双链DNA基因组高度压缩、重复利用，容易变异。

7. 4.乙肝的发病机理 • HBV不引起直接肝细胞病变，病毒整合到肝细胞复制，表达肝细胞表面，免疫系统清除。如免疫力强，临床经过为急性肝炎；如免疫力低下，临床经过为慢性肝炎；如免疫耐受，则和机体和平共处，为病毒携带者。

8. 5.治疗 • 急性：早发现早治疗，对症支持治疗。 • 慢性：抗病毒，免疫调节，对症治疗，心理治疗。其中抗病毒治疗最为关键，可延缓肝硬化、肝癌病情的演化和发展。

9. 6.乙肝的常用实验室检查项目及临床意义 1.肝功能：主要为谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）， 1) ALT主要存在于肝细胞胞浆中; 2) AST主要存在于肝细胞线粒体中，肝脏炎症坏死时释放入血，为肝细胞损害指标。 但是除了病毒性肝炎外，其它类型的肝炎或肝脏疾病，ALT、AST也会升高。

10. 2. 两对半：HBV感染后病毒分泌的蛋白释放入血液，这些蛋白具有抗原性，导致机体产生相应的抗体。 • 乙肝病毒的抗原抗体共有三个系统，但因核心抗原（HBcAg）在血清中一般不易检出，仅其余两对半在血液中可检测出，故俗称“两对半”，即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，为HBV感染依据，间接判断病人感染状态。

11. 其中HBsAg和抗HBs是病毒的外膜蛋白和相应抗体。e抗原和e抗体是病毒的核壳分泌蛋白和相应抗体。HbcAg和抗HBc是病毒的核壳结构蛋白和相应抗体，但HBcAg在血液中一般检测不到。其中HBsAg和抗HBs是病毒的外膜蛋白和相应抗体。e抗原和e抗体是病毒的核壳分泌蛋白和相应抗体。HbcAg和抗HBc是病毒的核壳结构蛋白和相应抗体，但HBcAg在血液中一般检测不到。 3. HBV-DNA：PCR 4. 肝活检：肝穿刺，确诊肝炎类型的金指标。 • 乙肝病毒复制指标为HBeAg、HBV-DNA，此二项阳性者传染性强。

12. 标记免疫技术 标记免疫是具有高度特异性的免疫技术和高度敏感性的标记技术相结合的特点.

13. 按标记不同，标记免疫分析分为： • 放射免疫分析（radioimmunoassay, RIA）：放射性核素作标记。 • 酶免疫分析（enzyme immunoassay, EIA）：酶作标记。 • 荧光免疫分析（fluorescence immunoassay, FIA）：荧光物作标记。 • 发光免疫分析（luminescence immunoassay, LIA）：发光物作标记。

14. 酶免疫技术 1.原理：以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。酶结合物既保留抗体（或抗原）的免疫学活性，又保留酶对底物的催化活性。 2.特点：灵敏度高、特异性强、准确性好、试剂稳定、方法简便易行

15. 酶免疫技术分类：

16. ELISA中最常用的酶 • HRP ：分子量较小，标记物易透入细胞内，酶及酶标记物比较稳定，易保存溶解性好 • AP：分子量较大，不易透入细胞内，敏感性高 • b-Gal：人血中缺乏此酶，在测定时不易受到内源性酶的干扰，常用于均相酶免疫测定。

17. 辣根过氧化酶（HRP）对应的底物OPD和TMB的比较

18. 碱性磷酸酶和β半乳糖苷酶的比较

19. 二、实验原理 • 两对半ELISA检测原理 1） HBsAg：双抗体夹心法 ——正比 单克隆HBsAb－HBsAg－多克隆HBsAb－HRP 2）HBsAb：双抗原夹心法 ——正比 HBsAg－HBsAb－HBsAg－HRP

20. 3）HBeAg：双抗体夹心法 ——正比 单克隆HBeAb－HBeAg－多克隆HBeAb－HRP 4）HBeAb：竞争抑制法 ——反比 多克隆HBeAb－HBeAg－HBeAb－HRP \ HBeAb（标本） 5）HBcAb：竞争抑制法 ——反比 HBcAg－HBcAb－HRP \ HBcAb（标本）

21. 2.结果判断： 1）HBsAg、HBsAb、HBeAg： 样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1为阳性，＜2.1为阴性（OD＜0.05按0.05计算） 2）HBeAb：COV＝（阴性对照平均OD值＋阳性对照平均OD值）/2 标本OD值≥COV为阴性，＜COV为阳性 3）HBcAb：原倍血清COV＝阴性对照平均OD值×0.3 标本OD值≥COV为阴性，＜COV为阳性

22. 两对半金乳胶ICA检测原理 • 原理同ELISA，HBeAb、HBcAb质控区包被的分别为HBeAb、HBcAb抗体，HBsAg、HBsAb、HBeAg质控区包被的为第一物质的抗体。质控是为了判断层析是否正常，内控标准。

23. 结果判断 • 阳性：HBsAg、HBsAb、HBeAg为两条红色条带出现，HBeAb、HBcAb为T区无条带C区出现一条红色条带 • 阴性：HBsAg、HBsAb、HBeAg为T区无条带C区出现一条红色条带，HBeAb、HBcAb为两条红色条带出现 • 无效：C区未出现红色条带

24. 三、方法和步骤（见说明书） • 两人一组，ELISA每个指标每组7孔，阳性对照、阴性对照、样本分别2孔，1孔空白对照。乳胶ICA为两人一块检测试剂板。

25. 四、结果报告

26. 结果分析 • HBsAg： • 不具有传染性，是乙肝病毒感染的标志，最先出现的指标，在ALT上升前2～8周可测出。 • 急性肝炎早期可转阴，慢性肝炎持续阳性。如阳性持续大于6个月转阴的可能性小。 • 另要注意HBsAg（—）HBV感染。 • 滴度的高低与传染性一致，和病变轻重不一，重型低，慢性高。

27. HBsAb： • 为中和抗体，保护性抗体，一旦出现说明机体产生保护性免疫力。 • 疫苗免疫成功的指标。（有效期为5年） • 要注意有HBsAb（＋）的乙肝患者，为不同亚型感染所致。

28. HBeAg： • HBV复制指标，存在于Dane颗粒中，为HBV复制的副产物。 • 在HBsAg阳性出现后几天可检出，说明传染性大。 • 通常阳性时HBsAg也检出阳性。 • 阳性持续大于10周说明慢性化可能。

29. HBeAb： • HBeAg转阴后出现。 • 较HBsAb出现晚，消失早。

30. HBcAb： • HBcAg包裹在外膜中，血清中检测不出。 • HBcAb继HBsAg、HBeAg后检出，出现较早。 • 早期为IgM，以HBcAb－IgM作为急性感染指标。 • 慢性及急性感染恢复期以IgG为主。

31. 常见检测类型及分析

32. 思考题 1. ELISA和ICA的比较。

33. 乙肝相关知识 • 慢性乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的慢性、传染性疾病，严重危害健康，影响生活质量。 • 1.乙肝的流行病学 全世界半数以上的人被感染过，5％为慢性感染，每年有5000万新感染，100万死亡。我国有9.8％HBsAg（＋），慢性达1000万，60％人群感染。

34. 2.传播途径 • 传染源：HBV携带者、乙肝患者血液、体液（精液、阴道分泌物、唾液） • 传播途径：血液、血制品、性、垂直、日常密切接触 • 易感人群：母亲是HBV感染的婴儿、HBV感染家庭成员、吸毒者、性病病人、血透病人、部分医护人员

35. 3.乙肝病毒的形态结构、基因组的特点 • HBV颗粒：小球形颗粒（无病毒核酸，无感染性）——病毒颗粒包膜产生过剩 • 管形颗粒（小球颗粒连接而成） • Dane颗粒（具有感染性的完整颗粒） • 基因：已知DNA病毒中颗粒最小的，带有部分单链区的双链DNA基因组高度压缩、重复利用，容易变异。

36. 3.乙肝病毒的形态结构、基因组的特点 • HBV颗粒：小球形颗粒（无病毒核酸，无感染性）——病毒颗粒包膜产生过剩 • 管形颗粒（小球颗粒连接而成） • Dane颗粒（具有感染性的完整颗粒） • 基因：已知DNA病毒中颗粒最小的，带有部分单链区的双链DNA基因组高度压缩、重复利用，容易变异。

37. 思考题 • ELISA和ICA的比较。 • 金标法的优缺点？