第一节基因表达的机制

第一节基因表达的机制 一、有效表达的三个环节 1.转录起始（关键和限速步骤）转录宿主RNA聚合酶启动子

2.mRNA的延伸与稳定性 非特异性终止:衰减子,抗终止序列正确终止转录终止序列 mRNA稳定性与Poly(A)尾有关载体上添加 Poly(A)掺入信号宿主RNase缺失,增强mRNA稳定性

终止子 • 强化转录终止的必要性 • 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物 • 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： • 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； • 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； • 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； • 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率

3．mRNA有效翻译 原核翻译 ⑴AUG起始密码子 ⑵SD序列:与16SrRNA互补结合位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基 ⑶SD序列与ATG之间合适距离3-9bp ⑷翻译起始区间内不形成明显二级结构终止密码子：RF1---UAA UAG RF2---UAA UGA

4．外源蛋白的稳定性 融合蛋白分泌蛋白表达系统包涵体表达系统使用蛋白水解酶基因缺陷型受体细胞

5.目的基因的沉默 • 1）位置效应甲基化程度高，转录活性低的异染色质上 • 2）转录水平基因沉默启动子甲基化和外源基因的异染色质化重复序列(repeat sequences)可导致自身甲基化 • 3）转录后水平基因沉默共抑制(cosuppression)是转录后水平基因沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。

第二节外源基因在大肠杆菌中的表达 一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征（一）大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物

（二）大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素

二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 （一）启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列，其大小在20～300个碱基长度范围内，具有转录目标基因的mRNA的功能。

（二）核糖体结合位点 • 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列特征结构要素： • SD序列； • 翻译起始密码子； • SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； • 基因编码区5′端若干密码子的碱基序列。

3′ 核糖体小亚基上的16S-rRNA CACUAGG A C U C U C C U 5′ A G G A Pu Pu U U U Pu Pu AUG mRNA 起始密码 SD序列原核生物mRNA与核糖体结合的分子机制

1．SD序列的影响 SD序列与16S rRNA的碱基互补性 • 一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低

2．SD序列与起始密码子之间的序列的影响 SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍

3．SD序列与起始密码子之间的距离的影响 翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位。 SD序列位于AUG之前大约七个碱基处。

4．起始密码子及其后续若干密码子的影响 • 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。 • 从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 • 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的

（三）密码子对外源基因表达的影响 1．生物体对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。其决定因素是：

生物基因组中的碱基含量 • 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势 • 密码子与反密码子相互作用的自由能 • 性中等强度规律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多； • 细胞内tRNA的含量

外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达的两种策略外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达的两种策略 • ⑴外源基因全合成 • ⑵同步表达相关tRNA编码基因

（四）质粒拷贝数 • 质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 • 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道。

三、外源基因在大肠杆菌中表达的形式 （一）包涵体及其性质在一定的条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。

（二）以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 1．包涵体表达形式的优点：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分。大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。

2．包涵体表达形式的缺点 包涵体变性复性操作的技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。

3．以包涵体形式表达目的蛋白的操作 • 如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。

（三）分泌型异源蛋白的表达 • 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。 • 蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。

1．分泌表达形式的优点 ⑴目的蛋白稳定性高，重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳定性大约是在细胞质中的10倍 ⑵目的蛋白易于分离 ⑶目的蛋白末端完整，N端的甲硫氨酸残基可在信号肽的剪切过程中被有效除去。

2．分泌表达形式的缺点 相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。

分泌型目的蛋白表达系统的构建 • 绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。

（三）融合型异源蛋白的表达 • 融合蛋白:将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。 • 在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。 • 通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。

凝血因子Xa

以融合形式表达目的蛋白的优缺点 • 1．目的蛋白稳定性高，尤其对分子量较小的多肽效果更佳。 • 2．目的蛋白易于分离，利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白，然后通过蛋白酶水解或化学法特异性裂解受体菌蛋白与外源蛋白之间的肽键，获得纯化的外源蛋白产物。 • 3．目的蛋白表达率高，与受体蛋白共用一套完善的表达元件，受体菌自身蛋白基因的SD序列和碱基组成等有利于基因的表达。

4．目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性和一定的生物活性。4．目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性和一定的生物活性。 • 5．目的蛋白需要回收，融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该步骤。

（四）寡聚型异源蛋白的表达 • 随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量受到影响。

另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略。另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略。

1．多表达单元重组，表达的外源蛋白不须经过裂解处理，这种方式适合于表达分子质量较大的蛋白。1．多表达单元重组，表达的外源蛋白不须经过裂解处理，这种方式适合于表达分子质量较大的蛋白。 • 2．多顺反子重组表达的外源蛋白分子是相互独立的，这种方式对表达中等大小分子质量的外源蛋白比较合适。 • 3．多编码序列重组，这种方式特别适合表达外源小分子蛋白或多肽。

（五）整合型外源蛋白 • 将外源基因整合到染色体的非必需编码区，使之不干扰宿主细胞的正常生理代谢。 • 同源重组：重组对之间需要有同源性。调节这一过程的蛋白（如大肠杆菌中的RecA）不是序列专一性的，而是同源依赖的。经常设计长的同源区域。

四、在大肠杆菌高效表达目的基因的策略 • 1.优化表达载体设计 • ⑴启动转录起始的启动子序列 • ⑵决定mRNA翻译的SD序列的优化 • 2.提高稀有密码子tRNA的表达作用 • 如：Pro CCG CCC CCU和CCA

3.提高外源基因mRNA的稳定性 • 减少核酸外切酶可能对外源基因的切割作用 • 改变外源基因mRNA的结构，使之不易被降解

4.提高外源基因表达产物的稳定性 • 使用蛋白水解酶缺陷宿主 • 分泌型载体 • 对外源蛋白中水解酶敏感序列修饰和改造 • 融合蛋白 • 5.优化发酵过程 • 工艺：选用合适的发酵罐 • 生物方面 • ⑴O2 PH.T.培养基成分 • ⑵表达条件先成长后表达 • ⑶表达量菌体密度X 单菌表达水平

第三节外源基因在酵母菌中的表达 • 一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 • 1．酵母菌的分类学特征 • 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。

全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便。全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便。 2．酵母菌表达外源基因的优势能将外源基因表达产物分泌至培养基中不含有特异性的病毒、不产内毒素。具有原核细菌无法比拟的真核蛋白质翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉

二、酵母菌的宿主系统 ⑴酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae） • 优点：无毒利用历史长 • 缺点：发酵过程产生酒精影响酵母的生长代谢和基因表达、蛋白质加工易过度糖基化，分泌能力不高，产物：乙肝疫苗、人胰岛素，人粒细胞集落刺激因子 ⑵巴斯德毕赤酵母（Pichia storis） • 甲基营养菌甲醇诱导型，乙醇氧化酶基因Aoxl表达产物可高达细胞总蛋白30%，使用Aoxl高效启动子，宿主用Aoxl基因缺失的突变株做为受体细胞，具有良好的分泌特性。产物：乙肝表面抗原、人肿瘤坏死因子，人表皮生长因子，链激酶。

⑶乳酸克努维酵母（Kluyveromyces lactis • 遗传背景清楚，载体在酵母中稳定存在，无选择压力可以不会丢失，真核蛋白可形成正确的构像，对表达高等哺乳动物蛋白有优越性。产物：白介素和牛凝乳素 ⑷多型汉森酵母（Hansenula polymorpha) • 甲基营养菌，现在以其为表达宿主的研究比较少，但他的营养缺陷型找到，还有可以在其内表达相应的质粒

三、酵母基因表达载体 • 1.元件组成 • ⑴DNA复制起始区：来自2μm质粒或酵母基因组中的自主复制序列ARS,大肠杆菌的复制起始序列 • ⑵选择标记：酵母宿主为营养缺陷型，筛选标记就是营养合成代谢途径中相应的基因。

⑶有丝分裂稳定区：有丝分裂稳定区能帮助载体在母细胞和子细胞之间平均分配。来源于酵母染色体的着丝粒片段。⑶有丝分裂稳定区：有丝分裂稳定区能帮助载体在母细胞和子细胞之间平均分配。来源于酵母染色体的着丝粒片段。

⑷表达盒 • ①启动子：上游激活序列（UAS）、上游阻遏序列（URS）和组成型启动子序列。核心启动子序列包括转录起始点和TATA序列。 • ②分泌信号：启动子下游有来自酵母本身的分泌蛋白的信号肽，引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻译后的加工起重要作用。 • ③终止子：是mRNA3′末端形成效率的重要元件，酵母中mRNA3′末端的形成，需经过前体mRNA加工和多聚腺苷酸酸化反应。

2.酵母载体的种类 • ⑴自主复制型质粒载体（YRp,yeast replicating plasmid） • ⑵整合型质粒载体（YIp,yeast integrating plasmid） • ⑶着丝粒型质粒（YCp,yeast centromeric plasmid） • ⑷酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC

四、在酵母中高效表达外源基因的策略 • 1．选择合适的受体细胞系统 • 2．提高外源基因的转录水平 • 强启动子：酵母磷酸甘油酯激酶（PGK）基因启动子；甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）基因启动子。 • 但有时强启动子启动外源基因转录会造成细胞中表达产物含量过高，而对细胞形成伤害。

第一节 基因表达的机制