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Paramètres à considérer

16:0. 16:1. 18:1. palmitic. palmitoleic. oleic. 18:0. 18:3n-3. 18:2n-6. stearic. linoleic. α-linolenic. Paramètres à considérer. Les plantes produisent déjà les précurseurs, c’est-à-dire l’acide linolé ϊ que (18:2n-6) et l’acide α -linolénique (18:3n-3). Δ7des. Om e ga 3. Δ15des.

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Presentation Transcript


  1. 16:0 16:1 18:1 palmitic palmitoleic oleic 18:0 18:3n-3 18:2n-6 stearic linoleic α-linolenic Paramètres à considérer • Les plantes produisent déjà les précurseurs, c’est-à-dire l’acide linoléϊque (18:2n-6) et l’acide α-linolénique (18:3n-3) Δ7des Omega 3 Δ15des elo elo Omega 6 Δ12des Δ9des

  2. 16:0 16:1 18:1 palmitic palmitoleic oleic 18:0 18:3n-3 18:2n-6 stearic linoleic α-linolenic Δ9elo Δ6des 20:3n-3 18:4n-3 stearidonic eicosatrienoic Δ8des Δ6elo 20:4n-3 eicosatetraenoic Δ5des 20:5n-3 eicosapentaenoic, EPA 22:5n-3 Δ5elo ω3-docosapentaenoic 22:6n-3 Δ4des docosahexaenoic, DHA Paramètres à considérer • Les plantes produisent déjà les précurseurs, c’est-à-dire l’acide linoléϊque (18:2n-6) et l’acide α-linolénique (18:3n-3) • Pour transformer les acides gras de plantes en LC-PUFAs • il faut plusieurs enzymes (désaturases, élongases, mais aussi • des acyltransférases, et des enzymes d’activation des acides gras) • Ceci nécessite donc de transformer des plantes oléagineuses • avec plusieurs gènes  difficultés technologiques Δ7des Omega 3 Δ15des elo elo Omega 6 Δ12des Δ9des

  3. Substrats des désaturases et des élongases Phospholipid pool Acyl-CoA pool α-linolenic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine 18:3n-3PC Δ6des LPCAT* ACS** Stearidonic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine 18:4n-3CoA 18:4n-3 PC 18:4n-3 Δ6elo LPCAT* Eicosatetraenoic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine 20:4n-3 PC 20:4n-3CoA Δ5des Eicosapentaenoic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine 20:5n-3 PC EPA *Δ6-specific lysophosphatidylcholine acyltransferase **Acyl-CoA synthetase

  4. Les élongases -Complexe qui regroupe 4 enzymes -La première enzyme est responsable de la spécificité de substrat

  5. Structure des LC-PUFAs désaturases (“front-end desaturase”, front = COOH) (around 450 aa) Amino acid sequences of membrane-bound fatty acid desaturases from plants, animals and other organisms have three strongly conserved histidine-rich sequences (His boxes) with the general motifs HXXXH, HXXHH and HXXHH. These boxes are required for enzyme activity and are separated by membrane-spanning domains that must provide the correct orientation for the active sequences. Many enzymes including the mammalian Δ5 and Δ6 desaturases contain a cytochrome b5-like N-terminal extension; this is often accompanied by a change in the third His box to QXXHH (as shown). Electrons acquired from NADH cytochrome b5 reductase are transferred to cytochrome b5 or the cytochrome b5 domain of the desaturase, and then to the active site of the desaturase. The mixed oxidation/reduction reaction proceeds through two iron atoms (green circles) that are stabilized by interaction with the conserved histidine boxes. Wallis et al., TIBS, 2002

  6. Les microalgues: une large gamme de choix Part of a maximum-likelihood tree constructed using 18S rRNA sequences (adapted from Lopez-Garcia P. et al., Nature, 2001) (Thalassiosira pseudonana) (Phaeodactylum tricornutum) or Nannochloropsis oculata (Pavlova lutheri, Isochrysis galbana)

  7. De nombreux articles décrivent des profils lipidiques de microalgues

  8. (18:2n-6 et 18:3n-3 are present in plants) Omega 6 Omega 3 Δ15des 18:3n-3 18:2n-6 Δ9elo Δ9elo Δ6des Δ6des linoleic α-linolenic 20:3n-3 18:4n-3 18:3n-6 20:2n-6 stearidonic γ-linolenic eicosadienoic Δ8des Δ6elo Δ8des Δ6elo 20:4n-3 20:3n-6 eicosatetraenoic dihomo-γ-linolenic Δ5des Δ5des 20:5n-3 20:4n-6 eicosapentaenoic, EPA arachidonic Δ5elo Δ5elo 22:4n-6 22:5n-3 adrenic ω3-docosapentaenoic Δ4des Δ4des 22:6n-3 22:5n-6 docosahexaenoic, DHA ω6-docosapentaenoic Microalgues = source de gènes codant pour des élongases et des désaturases eicosatrienoic Oméga 3 désaturase Cette liste est loin d’être exhaustive…

  9. Faisabilité de la reconstitution de la voie de synthèse du DHA chez un hôte hétérologue in Yeast 18:4n-3 Δ6elo: T. pseudonana Δ5des: P. tricornutum Δ5elo: O. tauri Δ4des: E. gracilis  DHA DHA: ~ 0,5-1 % des AG totaux

  10. 18:3n-3 18:2n-6 linoleic α-linolenic 18:3n-6 20:2n-6 γ-linolenic eicosadienoic 20:4n-3 20:3n-6 eicosatetraenoic dihomo-γ-linolenic 20:5n-3 20:4n-6 eicosapentaenoic, EPA arachidonic 22:4n-6 22:5n-3 adrenic ω3-docosapentaenoic 22:6n-3 22:5n-6 docosahexaenoic, DHA ω6-docosapentaenoic Reconstitution de la voie de synthèse des oméga 3 chez les plantes Omega 6 Omega 3 Δ15des lin Δ9elo Δ9elo Δ6des Δ6des Arabidopsis thaliana 20:3n-3 18:4n-3 stearidonic Δ8des Δ6elo Δ8des Δ6elo Δ5des Δ5des tabac soja colza Oméga 3 désaturase Δ5elo Δ5elo - objectif: « Si une huile végétale contient environ  5% d’ARA, 5% d’EPA et 5% de DHA, 10 g de cette huile (quantité suffisante pour préparer une vinaigrette) permettraient d’ingérer la quantité journalière suffisante de LC-PUFAs » Δ4des Δ4des Domergue et al., TIPS, 2005

  11. 18:3n-3 α-linolenic 20:4n-3 eicosatetraenoic 20:5n-3 eicosapentaenoic, EPA Volume 22, 739-745, 2004 Δ9elo: from I. galbana X Δ6des 20:3n-3 18:4n-3 stearidonic eicosatrienoic X Δ8des: from E. gracilis Δ6elo Δ5des: from Mortierella alpina - Promoteur constitutif - Transformation séquentielle

  12. Ces résultats ont permis de démontrer la faisabilité de ce type d’expérience chez les plantes, mais production chez Arabidopsis et dans les feuilles

  13. 18:3n-3 α-linolenic 20:4n-3 eicosatetraenoic 20:5n-3 eicosapentaenoic, EPA X Δ6des from P. tricornutum Δ9elo 20:3n-3 18:4n-3 stearidonic eicosatrienoic Δ6elo from moss X Δ8des Δ5des from P. tricornutum • promoteur spécifique des graines • une seule transformation  meilleurs résultats avec la construction C

  14. Production d’EPA que chez le tabac, et dans les graines

  15. Δ15des Δ6des Δ6des Δ15des 18:4n-3 18:3n-3 18:2n-6 stearidonic linoleic α-linolenic Δ6elo Δ6elo Δ17des 18:3n-6 γ-linolenic Δ5des Δ5des 20:4n-3 Δ17des 20:3n-6 eicosatetraenoic dihomo-γ-linolenic Δ5elo Δ5elo Δ17des 20:5n-3 20:4n-6 eicosapentaenoic, EPA arachidonic Δ4des Δ4des 22:4n-6 22:5n-3 adrenic ω3-docosapentaenoic 22:6n-3 22:5n-6 docosahexaenoic, DHA ω6-docosapentaenoic • - Plante hôte = soja • - Transformation d’embryon somatique par biolistique • - Promoteurs spécifiques des graines • - Pour la production d’EPA: 2 constructions testées • (Saprolegnia diclinaΔ6des + Mortierella alpinaΔ6elo + Mortierella alpinaΔ5des) • (Arabidopsis thalianaΔ15des + Saprolegnia diclinaΔ17des) • pour la production de DHA : 2 constructions testées • (Saprolegnia diclinaΔ6des + Mortierella alpinaΔ6elo + Mortierella alpinaΔ5des) • (Pavlova sp. Δ5elo +Schizochitrium aggregatumΔ4des + Saprolegnia diclinaΔ17des)

  16. Nouvelles stratégies pour augmenter la production de LC-PUFAs et le stockage dans les TAGs: - Acyl-transférases - Acyl-CoA synthétase specifiques de l’EPA et du DHA ?

  17. FA1 FA1 H FA2 FA2 H P P FA3 FA1 H P Production et stockage des LC-PUFAs Kennedy pathway: AcylTransferases in endoplasmic reticulum Glycerol 3-P G3PAT Fatty acid synthesis: inplastid (until 18:1), and in endoplasmic reticulum acyl-CoA pool lysoPA LPAAT PA acyl-CoA synthetase PAPase FAs DAG elo CPT 26:0 28:0 30:0 DGAT PC acyl-CoA LPCAT PDAT TAG elo: elongase X: X-desaturase lysoPC

  18. Addition de nouvelles enzymes: acyltransférases

  19.  ARA: jusqu’à 25% EPA: jusqu’à 15%

  20. Acyl-CoA synthétases de Thalassiosira pseudonana Acyl-CoA synthétase = activation des AG: AG + ATP + acyl-CoA  acyl-CoA + AMP  Thalassiosira pseudonana (Diatomée) Genomic DNA library CNAP server 31.03.03

  21. Composition en AG et acyl-CoA de Thalassiosira pseudonana co-elution Tonon et al., Plant Physiology, 2005

  22. Acyl-CoA synthétases de Thalassiosira pseudonana Acyl-CoA synthétases connues Tonon et al., Plant Physiology, 2005

  23. Culture time t1 t2 t3 t4 Incubation (h) 95 173 237 311 % nitrate degraded 5 30 60 100 Expression des gènes TpLACS t1 t2 t3 t4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 18S rDNA (675 bp) TplacsA (324 bp) TplacsI (543 bp) expression hétérologue dans la levure Tonon et al., Plant Physiology, 2005

  24. Expression de TplacsA dans les levures et incubation en présence de 18:4n3+20:5n3 Résultats similaires en présence de 18:3n6+20:4n6  TpLACSA peut activer les LC-PUFAs Tonon et al., Plant Physiology, 2005

  25. Activité spécifique de TpLACSA PACS = Pseudomanas sp. acyl-CoA synthetase (Sigma), connue pour son spectre large d’activité 80 2000 pYES2 pYLACSA PACS 1500 60 PACS specific activity (pmole/min/mg protein) Yeast extracts specific activity (pmole/min/mg protein) 40 1000 20 500 0 0 16:0 18:3n-6 18:4n-3 20:4n-6 20:5n-3 22:6n-3 Fatty acid substrate TpLACSA est très active sur les LC-PUFAs, en particulier le DHA Tonon et al., Plant Physiology, 2005

  26. TpLACSA peut-elle augmenter le stockage du DHA dans la levure? La réponse est oui  prochaine étape = expression chez la plante Tonon et al., Plant Physiology, 2005

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