Técnicas de Laboratorio para la Investigación de los Efectos Ambientales en los Seres Vivos

1. Programa de Doctorado "Gestión y Salud Ambiental“ Curso 2010-11 Técnicas de Laboratorio para la Investigación de los Efectos Ambientales en los Seres Vivos

2. III PARTE: Introducción a la Microscopía Electrónica. III PARTE: Introducción a la Microscopía Electrónica. Sesiones Teóricas: 1. Introducción a la Microscopía Electrónica. 1.1. Fundamentos de la Microscopía Óptica y Electrónica. 1.2. Tipos de microscopios electrónicos. 1.3. Breve historia de la Microscopía Electrónica. 1.4. Aplicaciones. 1.5. Ejemplos. 2. Tratamiento de muestra para Microscopía Electrónica. 3. Técnicas avanzadas de fijación, inclusión y detección en Microscopía Electrónica de Transmisión. Sesiones Prácticas: 1. Pre-tratamiento de muestra. 2. Obtención de cortes ultrafinos para Microscopía Electrónica de Transmisión. 3. Observación de muestras a Microscopio Electrónico de Transmisión.

3. 1.1. Fundamentos de la microscopía óptica y electrónica.

4. Sistema de alto vacío Esquema de una Bomba Rotatoria Esquema de una Bomba Difusora

5. Analogías y diferencias entre microscopio óptico y electrónico

6. 1.2. Tipos de microscopios electrónicos.

7. Pared celular nucleolo citosol TRANSMISIÓN Membrana nuclear núcleo BARRIDO

8. Esquema y foto de un MET

9. Esquema y foto de un MEB

10. 1.3. Breve historia de la Microscopía Electrónica. 1897 J. J. Thompson (P. N. Fisica 1906) anuncia la existencia de partículas cargadas negativamente, denominadas luego electrones. 1924 Louis-Victor de Broglie (P.N. Fisica 1930) propone que los electrones en movimiento tienen propiedades ondulatorias. 1926 Busch prueba que es posible enfocar un haz de electrones con una lente magnética cilíndrica, estableciendo las bases de la óptica electrónica. 1931 Ernst Ruska (P.N. Fisica 1986) y colegas construyen el primer microscopio electrónico de transmisión. 1932 A.C. Van Dorsten (Philips Research Laboratories) comienza a estudiar las lentes magnéticas. 1935 Max Knoll demuestra la factibilidad del microscopio electrónico de barrido; tres años después Von Ardenne construye un instrumento prototipo. 1939 Siemens produce el primer microscopio electrónico de transmisión comercial. 1942 Microscopio Electrónico de Transmisión de 400 kV desarrollado por Philips Research Laboratories. 1944 William and Wyckoff introducen la técnica de sombreado metalico. 1945 Porter (P.N. Fisiologia y Medicina 1972), Claude (P.N. Fisiologia y Medicina 1974) y Fullam utilizaron el microscopio electrónico para examinar células en cultivo de tejidos luego de fijarlas y teñirlas con tetróxido de osmio. 1946 Philips introduce su primer prototipo de microscopio electrónico comercial en Oxford. 1948 Pease y Baker preparan confiablemente secciones finas (0,1 a 0,2 mm de grosor) de material biológico. 1950 H. Latta y J. F. Hartman introducen la cuchilla de vidrio para ultramicrotomía. 1952 Palade (P. N. Fisiología y Medicina 1975) , Porter (P.N. Fisiología y Medicina 1972), y Sjöstrand desarrollan métodos de fijación y seccionamiento fino que permitieron ver por vez primera muchas estructuras intracelulares. En una de las primeras aplicaciones de estas técnicas, H. E. Huxley demostró que los músculos esqueléticos contienen un arreglo solapado de filamentos proteínicos, apoyando la hipótesis de los filamentos deslizantes de la contracción muscular. 1956 Glauert y asociados demuestran que la resina epóxica Araldita era un agente de embebimiento altamente efectivo para microscopía electrónica. 1959 Singer utiliza anticuerpos acoplados a ferritina para detectar moléculas en las células utilizando el microscopio electrónico. 1959 Brenner y Horne ampliaron la técnica de tinción negativa, inventada cuatro años antes por Hall, a una técnica de uso general para la visualización de virus, bacterias y filamentos proteínicos. 1961 Luft introdujo la resina de embebimiento Epón. 1963 Sabatini, Bensch y Barrnett introducen el glutaraldehido (usualmente seguido por tetróxido de osmio) como un fijador para la microscopía electrónica. 1965 Cambridge Instruments produce el primer microscopio electrónico de barrido comercial. 1966 Branton demuestra que la crio-fractura permite visualizar el interior de las membranas. 1968 de Rosier y Aaron Klug (P.N. Química 1982) describen las técnicas para la reconstrucción tridimensional de estructuras a partir de micrografías electrónicas. 1975 Henderson y Unwin determinan la primera estructura de una proteína de membrana mediante reconstrucción computacional de micrografías electrónicas de muestras no teñidas. 1993 Se logra la resolución de 1 Å en un Philips CM-200/300 en la Universidad de Tübingen.

11. 1.4. Aplicaciones. • Microscopio electrónico de barrido: • Geología: Investigaciones geomineras, cristalográficas, mineralógicas y petrológicas. Estudio morfológico y estructural de las muestras. • Estudio de materiales: Caracterización microestructural de materiales. Análisis cristalino. Valoración del deterioro. Tipo de degradación. • Metalurgia: Control de calidad y estudio de fatiga de materiales. • Odontología: estructura del esmalte y deterioro. • Paleontología y Arqueología: Caracterización de aspectos morfológicos. • Control de Calidad: Fibras, curtidos, etc. • Peritajes: Estudios de muestras de cualquiera de las áreas antes mencionadas. • Medicina Forense: Análisis morfológico de pruebas. • Biología (botánica), Biomedicinay Medicina: Estudio morfológico. • Estudio químico y estructural de obras de arte, alteración de monumentos, calidad, identificación de pigmentos (restauración, autentificación)

12. Control de calidad: lana o fibras especiales (mohair o Kashmir)

13. Imagen de la rotura de una varilla de acero obtenida mediante un Microscopio Electrónico de Barrido.

14. Ejemplos Diatomea Torno de dentista Velcro

15. Cristal de nieve

23. 1.4. Aplicaciones. • Microscopio electrónico de transmisión: • Investigación en Ciencias Biológicas. (Tamaño del objeto) • Diagnóstico de enfermedades de origen microbiano. Ejemplo: diagnóstico rápido de enfermedades víricas que proporciona la respuesta mucho antes que los métodos de cultivo tradicionales. • Ciencia de los materiales y metalurgia.

24. 1.5. Ejemplos: Microscopio Electrónico de Barrido y Óptico Lavandula latifolia (alhucema o espliego)

28. 1.5. Ejemplos: Microscopio Electrónico de Transmisión y Barrido Biología Celular

39. 2. Tratamiento de muestra para Microscopía electrónica. Microscopía Electrónica de Barrido 1.- Fijación. 2.- Deshidratación (punto crítico). 3.- Metalización (ion sputtering).

40. 2. Tratamiento de muestra para Microscopía electrónica. Microscopía Electrónica de Transmisión 1.- Fijación. 2.- Post-fijación. 3.- Deshidratación 4.- Inclusión en resina (polimerización) 5.- Corte (ultramicrotomo) 6.- Tinción con metales.

50. Microscopios disponibles en la Universidad de Huelva Microscopio electrónico de barrido (SEM-EDS). JEOL JSM 5410. El microscopio electrónico de barrido con detector de energía dispersiva (SEM-EDS) permite obtener imágenes microscópicas de minerales, polen, y tejido vegetal y animal. A través del detector EDS además se puede realizar microanálisis (en un punto de 2 µm de tamaño) de elementos mayoritarios. Además de imágenes de electrones secundarios (SEI) se puede obtener imágenes de electrones retrodispersados (BSEI) los cuales informan sobre las variaciones composicionales internas de la muestra.