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Cromatograf a

Cromatograf?a. . Cromatograf?a. . Cromatograf?a. . Cromatograf?a. . Descubridor . El bot?nico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 1872-1919) . Definici?n. Cromatograf?a es un m?todo de separaci?n en el que se aprovechan las diferencias en el comportamiento de partici?n entre una fase m?vil y una fase estacionaria para separa los componentes de una mezcla..

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Cromatograf a

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    1. Cromatografa

    2. Cromatografa

    3. Cromatografa

    4. Cromatografa

    5. Cromatografa

    6. Descubridor El botnico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 1872-1919)

    7. Definicin Cromatografa es un mtodo de separacin en el que se aprovechan las diferencias en el comportamiento de particin entre una fase mvil y una fase estacionaria para separa los componentes de una mezcla.

    8. Cromatografa, definicin (cont.) Una columna u otro soporte mantienen a la fase estacionaria y la fase mvil acarrea a la muestra. Los componentes de la muestra que particionan fuertemente con la fase estacionaria estarn ms tiempo dentro de la columna.

    9. Si es en columna : Conforme los componentes son eluidos de la columna, pueden ser cuantificados por un detector y colectados para anlisis posterior

    10. Mtodos cromatogrficos De gases En capa fina En lquidos inmovilizados De exclusin molecular Intercambio inico Hidroxiapatita Hidrofbica Afinidad HPLC

    11. Exclusin molecular Fase estacionaria: Dextrn con enlaces cruzados Agarosa con enlaces cruzado Poliacrilamida Las molculas grandes fluyen ms rpido que las pequeas.

    12. Desarrollo de una cromatografa de exclusin molecular Determinacin del tamao de la columna Hidratacin y lavado de la resina Empaque de la columna Determinacin del volumen vaco Corrimiento de la muestra

    13. Cromatograma de exclusin molecular (EM)

    15. Cromatografa de exclusin

    16. Caractersticas de las resinas de EM clsicas

    17. Intercambio inico

    18. Intercambio inico Las protenas difieren mucho en su afinidad por materiales cargados positiva o negativamente. Los soportes pueden ser: Dextrn con enlaces cruzados Agarosa con enlaces cruzado Poliacrilamida Celulosa Poliestireno Slice

    19. Grupos intercambiadores Carboximetilo (CM)

    20. Principios del intercambio inico La afinidad de una protena es proporcional a la concentracin de sal requerida para liberarla del material. Una columna se carga (de protenas) con un amortiguador de baja fuerza inica y la elusin se inicia por incremento de la concentracin del amortiguador de elusin.

    21. Desarrollo de una cromatografa de intercambio inico Hidratacin y Lavado de la resina Activacin (lavado con cido y base fuerte diluidos, HCl 1M seguido de NaOH 1M y finalmente con la sal que se usar ej. NaCl 1M y equilibrar con buffer sin sal) Volumen de la columna y capacidad de retencin de la resina.

    22. Diferentes sales tienen diferentes fuerzas de elucin cuando se usan en cromatografa de intercambio inico. Intercambio del anin citrato>sulfato>oxalato>I->NO3-2>CrO4->Br- > SCN- > Cl- > Formiato Intercambio del catin Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd > Cu > Co > Zn>Mg>Ti+> Ag > Rb+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

    23. Amortiguadores Para intercambiadores aninicos se deben usar amortiguadores catinicos o zwitterionicos No usar amortiguadores aninicos pues se unen a la resina. Usar detergentes catinicos o no inicos.

    24. Cromatograma de intercambio inico

    25. Hidroxiapatita (HA) Introducida por Tiselius et al. en 1956 Bernardi realiz un estudio sistemtico (Meth. In Enzimol. Vol. 22 y 27)

    26. Frmula Forma cristalizada de fosfato de calcio (Ca10(PO4)6(OH)2)

    27. Unin selectiva de protenas a la hidroxiapatita A, es una protena bsica. B, es una protena acdica El tringulo indica enlaces de coordinacin. Los dobles parntesis indican repulsin. Las lneas punteadas indican enlaces inicos.

    28. Adsorcin de grupos amino Se debe a interaccin electrosttica no especfica entre su cargas positivas y las cargas generales negativas de la columna de HA cuando la columna es equilibrada con amortiguador de fosfato.

    29. Incremento de la unin de aminas por bloqueo de la repulsin. A, es una protena bsica. B, es una protena acdica El tringulo indica enlaces de coordinacin. Los dobles parntesis indican repulsin. Las lneas punteadas indican enlaces inicos.

    30. Disociacin selectiva de la hidroxiapatita A, es una protena bsica. B, es una protena acdica El tringulo indica enlaces de coordinacin. Notar que estos no se afectan.

    31. Efecto de la concentracin de fosfato en la unin de protenas El perfil superior fue cargado con fosfato 1 mM El inferior, con fosfato 50 mM. La capacidad de unin de las IgG se mejor reduciendo la competencia de contaminantes.

    32. Barrido con dos gradientes El primer gradiente va de 0 a 500 mM de cloruro de sodio. El segundo, de 0 a 500 mM de fosfato de potasio. El amortiguador base es 0.5 M MES, 1mM fosfato, pH 6. La elusin de la IgG se observa en gris

    33. Usos Purificacin de: Protenas cidos nuclicos Virus

    34. Bases de la Tcnica Su selectividad no depende de la masa molecular, densidad de carga o punto isoelctrico.

    35. Bases de la tcnica La adsorcin y la elucin de las protenas no son procesos en reversa de un solo efecto. Los grupos amino y carboxilo actan de manera diferente en la adsorcin de las protenas a la HA. La elucin de protenas cidas y bsicas por diferentes sales tiene deferentes mecanismos.

    36. Ventajas HA tiene poco poder de adsorcin de molculas de masa molecular baja como nucletidos, sales y aminocidos. Es relativamente incompresible. Existen variantes cermicas ms fciles de trabajar pues no se compactan.

    37. Cromatografa hidrofbica

    38. Cromatografa Hidrofbica Los grupos adicionados al soporte son el alcohol octlico, grupos bencnicos u otros grupos hidrfobos como hidrocarburos (C4, C8 o C18). Los centros hidrfobos de las protenas son expuestos por exceso de salinidad y son atrapados por la columna.

    39. Cromatograma hidrofbico

    40. Series caotrpicas Aniones PO4>SO4>CH3COO>CL>Br>NO3>ClO4>I>SCN Cationes NH4+>Rb+>K>Na+>Cs+>Li+>Mg>Ca2+>Ba2+

    41. Cromatografa de Afinidad Sistema muy poderoso de purificacin Sistema restringido Se basa en la interaccin especfica de dos compuestos Antgeno - Anticuerpo Enzima - sustrato Receptor - Ligando

    43. HPLC Cromatografa lquida de alta resolucin High-performance liquid chromatography

    44. Limitaciones de la cromatografa a bajas presiones Imposibilidad fsica de aumentar el flujo Resinas compresibles Corridas de muchas horas Grandes volmenes

    45. Descubrimientos que facilitaron la HPLC Sntesis de resinas incompresibles Nuevas tcnicas en el empaque de las columnas Microparticulacin de las resinas Adelantos en la tecnologa espectrofotometrica

    46. Tipos de HPLC De exclusin molecular Intercambio inico Hidrofbica Afinidad De fase reversa

    47. Instrumentacin Sistema de bombeo Resistente a qumicos Poca variabilidad Presiones de 30 as 400 atm Flujo constante (libre de pulsos) Buen mezclado de los solventes Reproducibilidad en la formacin de los gradientes

    48. Tipos de bombas Jeringa Pistn recproco Diafragma Presin constante

    49. Detectores Detectores de UV-Visible que pueda leer 2 o ms longitudes de onda al mismo tiempo Detector de arreglo de diodos. Espectro de 200 a 600 nm en menos de 1 segundo.

    50. Cromatografa de fase reversa Se basa en las propiedades hidrofbicas de las protenas. El proceso de elucin es diferente que en la cromatografa hidrofbica La fase mvil es un solvente orgnico (metanol, 2-propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA, cido fosfrico, actico o hidroxibutrico).

    51. Fase estacionaria Slica acoplada con un derivado alquilsilano. La longitud de la cadena alquilo puede ser de C4, C8, C18. La porosidad del soporte es variable y se recomienda que sea entre 300 a 1000 A El tamao de las partculas es de 5 a 20 m

    52. Fase mvil La acidez de la fase mvil: Influencia el estado inico de la protena Controla la ionizacin de la superficie silanol Forma pares inicos con la zona catinica de la protena Favorece la exposicin de zonas hidrofbicas de la protena

    53. Cromatograma de fase reversa

    54. HPLC de Fase Reversa Separacin eficiente an con concentraciones altas de protenas Bajo ruido de fondo Solventes voltiles Fcil formulacin de la fase mvil Reproducibilidad de gradientes.

    55. Diagrama del sistema HPLC

    57. HPLC WATERS

    62. Cromatgrafo de Gases

    63. Principales componentes Gas de acarreo Controladores de flujo Inyectores Columnas Detectores Sistema de datos

    64. Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere el uso de un gas de complemento en el detector (make-up). El make-up, es un gas de arrastre adicionado al efluente de la columna antes de que pase al detector. El sistema del gas portador, por lo general contiene uno o varios tamices con el objeto de eliminar humedad, hidrocarburos y oxgeno. Los caudales utilizados en las columnas empacadas oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las capilares. Gas de acarreo

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