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聚合酶链式反应技术及其应用. 提 纲. 第一节 聚合酶链式反应扩增原理 第二节 PCR 反应体系和循环参数的优化 第三节 PCR 反应的问题与对策 第四节 一个常规 PCR 实验的设计 第五节 聚合酶链式反应技术类型 第六节 聚合酶链式反应技术应用 第七节 实时荧光定量 PCR 技术的原理及应用. 聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR)
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提 纲 第一节 聚合酶链式反应扩增原理 第二节 PCR反应体系和循环参数的优化 第三节 PCR反应的问题与对策 第四节 一个常规PCR实验的设计 第五节 聚合酶链式反应技术类型 第六节 聚合酶链式反应技术应用 第七节 实时荧光定量PCR技术的原理及应用
聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是近十几年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一。由于它具有强大的扩增能力，并且可与其他分子生物学方法(如核酸杂交)和免疫学方法(如ELISA)相结合应用，使其敏感性和特异性都大大增强，因而广泛地应用于生物医学领域的各个学科，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库，遗传病，传染病的诊断，法医学鉴定，物种起源，生物进化分析，流行病学调查，等等。由于PCR对世界生物医学研究的巨大推动作用，其发明者Mullis因而获得1992年诺贝尔医学奖。
最早报道的PCR是用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 经枯草杆菌蛋白酶处理后获得的Klenow片段来 催化DNA链的延伸。由于加热变性时酶会失活， 需要补加一份酶催化下一轮合成。这样不仅操 作复杂,而且由于酶反应的温度较低，DNA分子 会产生二级结构或引物非特异退火，使反应效 率低且易出现非特异性产物，同时，会增加污 染的机会。耐热DNA聚合酶的应用使PCR得以完 善。这种酶在加热95℃时不会变性，引物退火 和链的延伸可以在较高的温度下进行，因而使 得PCR的产率和特异性都大大提高。
PCR技术问世后，不仅迅速在生物医学领域得到广 泛应用，而且不断衍生出许多新的技术，使其应用范围 不断扩大，特异性和敏感性也不断提高。 比如反转录PCR(RT-PCR)是以mRNA为模板，通过 反转录反应合成cDNA，再做PCR扩增，因而可检测特异 的mRNA或得到其cDNA克隆； 如果仅有很少的序列资料，可通过锚式PCR对RNA 进行分析； 差异显示PCR（DD-PCR）可以鉴定和分离在不同条 件下(如机体或细胞受某种刺激或疾病时)某些有表达差异 的基因，而无需确切的序列资料； 免疫PCR是将PCR的强大扩增效力应用于免疫学检测 中，与传统方法相比其灵敏性要提高几个数量级； PCR- ELISA则是将PCR与核酸杂交、ELISA连为一 体，用ELISA鉴定PCR产物，避免了因使用Southern Blotting所带来的放射性污染等等。
第一节 聚合酶链式反应扩增原理 PCR是利用耐热DNA聚合酶在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的 基因体外扩增技术。它包括三个基本过程：
第一步 加热变性 靶序列 靶序列 模板DNA经94℃左右加热一定时间后，双链DNA解离成为单链。
靶序列 3’ 5’ 5’ 3’ Biotin Primer 1 Primer 2 Biotin 3’ 5’ 5’ 3’ 靶序列 第二步 引物与靶序列退火 模板DNA经加热变性成单链后，把温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
第三步 引物延伸 靶序列 3’ 5’ 5’ 3’ Primer 1 Biotin Biotin Primer 2 Taq DNA Polymerase 5’ 3’ 5’ 3’ 靶序列 DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以 靶序列为模板，dNTP为反应原料，按碱基配对原则， 合成一条新的与模板DNA链互补的单链。
第1个 PCR 循环完成后得到两个拷贝的靶序列 靶序列 靶序列
30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon
DNA扩增量呈指数上升 反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。 Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示每次扩增效率的平均值，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期。
PCR产物合成过程 平台期 指数期
第二节 PCR反应体系和循环参数的优化 （一）PCR反应体系 1、引物 2、耐热Taq DNA聚合酶 3、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） 4、镁离子 5、模板 6、缓冲液 （二）循环参数 1、变性的时间和温度 2、引物退火的温度与时间 3、延伸时间和温度 4、平台效应
（一）PCR反应体系 • 1、引物 • 2、耐热DNA聚合酶 • 3、脱氧核苷三磷酸 • 4、镁离子 • 5、模板 • 6、PCR缓冲液 • 7、ddH2O
和 或 和 Mg2+ Taq DNA 多 聚 酶 或Pfu DNA 多 聚 酶 Mn2+ dCTP dGTP dNTP 生 物 素 标 记 的 引 物 dUTP dATP
1、引物 在聚合酶链式反应中，要注意所用的引物浓度，一般引物控制在20~200pmol,这种浓度通常足以保证进行30轮以上的扩增。引物浓度偏高，会引起错配和非特异性产物的扩增，同时增加生成引物二聚体的几率。相反 ，如引物浓度不足，则聚合酶链式反应的效率极低。 引物设计是否合理，是决定PCR反应成败的关键。引物设计的原则见下表：
引物3’端互补后，经Taq酶聚合，形成双链的引物二聚体引物3’端互补后，经Taq酶聚合，形成双链的引物二聚体 引物自身的回文序列互补后产生的发夹结构
引物设计软件介绍 1、Primer 5.0（附中文说明书） 2、Oligo 6.0
2、耐热Taq DNA聚合酶 是一种耐热的、依赖于DNA的 DNA聚合酶，最初是从极端嗜热菌中纯化出来的。 功能：具 5 ′→3 ′DNA聚合酶活性，5 ’ →3 ′ 外切酶活性（在Q-PCR中此活性有用），但不具有3’ → 5’的外切酶活性（纠错功能），导致其碱基误掺入率偏高，不适用于突变检测、测 序分析和基因表达中（可用 Pfu 高保真聚合酶代替），另外，它还具有非模板依赖性聚合酶活性，在PCR合成终止后，在3’端加一个A,所以PCR产 物并非我们通常所想象的是一个平末端。利用此 特点，我们可以将PCR产物克隆到载体中。 特点：高度耐热，聚合反应的最佳温度为75 ℃～80℃; 价格相对便宜。在分子生物学中应用广泛。
3、三磷酸脱氧核苷酸 一般商品化供应的dNTP溶液pH为7.0，各dNTP的 浓度为 10mmol/L，一般使用浓度控制在20~200umol/L。四种各dNTP分子浓度必须相等，以减少错配。dNTP可与镁离子螯合，浓度过高时，Taq酶活性降低，PCR产量会减少。
4、镁离子 镁离子浓度对PCR反应影响很大，既影响到Taq DNA聚合酶的活性和真实性，又影响到引物退火、模板和PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体生成等。PCR体系中的镁离子浓度一般在0.5~2.5mol/L。商品化的试剂盒中，镁离子浓度一 般为1.5mol/L，不同反应体系所要求的浓度会有差异。
镁离子浓度与产物特异性和产率的关系 随着镁离子浓度升高PCR 产率和特异性均降低。
5、模板 聚合酶链式反应（PCR)的模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子；可以是线状分子，也可以是环状分子，不过线状分子比环状分子的扩增效果稍好。 就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量、纯度以及目的片段的GC含量，当扩增GC富含区时，可使用专门的GC Buffer作为缓冲液。 不同来源的DNA所需模板量不同，可参考《分子克隆》。
6、缓冲液 1）Tris-HCl缓冲液 2）KCl 3）明胶 4）牛血清蛋白 5）非离子型生物去污剂 一般这些成分均由商家提供，并做过优化处理，不需要自己配制。
（二）循环参数 聚合酶链式反应（PCR）参数包括循环中三阶段的温度及持续时间控制，以及循环的次数，这在一定程度上影响着聚合酶链式反应的成功与否 。通常PCR 反应所采取的反应参数为： 变性温度 94℃ 30～60s 退火温度 38~65 ℃ 30～60s 延伸温度 72 ℃ 45～60s 循环次数 30~35次 复性温度决定于所用引物的长短与碱基组成，一般需要通过预实验来确定。
1、变性的时间和温度 模板DNA的变性不充分是导致PCR失败的一个重要原因。 一般在第一轮循环前先进行94℃预变性3~5min，以便使模板DNA完全解链。
2、引物退火的温度与时间 引物的退火温度和所需时间长短取决于反应体系中扩增的基因组成及引物的长度、浓度和碱 基组成。 实际使用的退火温度一般要比引物的Tm值低2～5℃。 Tm＝4×(G+C)＋2×(A+T) 一般当引物中G+C含量高、长度较长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。 当然， 退火温度也不能过高 ，否则引物不能与模板很好得结合，得不到扩增产物。退火通常需要30~60s。
3、延伸时间和温度 延伸的时间长短取决于目的序列的长度、使用的PCR仪等。 一般引物延伸是在72 ℃下进行。对2Kb以上长片段DNA的扩增可适当延长时间 。
4、平台效应 引起平台效应的因素： （1）dNTP或引物等消耗殆尽 （2）酶活性逐渐降低 （3）最终产物的阻化作用 （焦磷酸盐、双链DNA） （4）非特异性产物或引物的 二聚体与反应模板的竞争作用
第三节 PCR反应的问题与对策 • 问题一、无产物 • 问题二、非特异性扩增 • 问题三、空白对照有扩增（有污染）
利用尿嘧啶N-糖苷酶（UDG）解决遗留污染的方法利用尿嘧啶N-糖苷酶（UDG）解决遗留污染的方法 原理：UDG可以切断含有尿嘧啶核苷的DNA双链。 方案一：dUTP方案 是在所有的PCR反应中均用dUTP代替dTTP，这样产生的PCR产物中除引物位置外，dTTP处被dUTP代替，这并不影响对其进行克隆等操作。在每次PCR之前，均将设置好的PCR反应体系用UDG处理，那么其中的遗留污染DNA(假如有的话)将被破坏，不能作为下面PCR反应的底物，由于在后续的热变性过程中UDG将被灭活，所以事先加入的UDG不会对本反应的产物构成任何影响。
方案二：dU引物方案。 即在引物合成过程中用dUTP代替dTTP，用这类引物引导合成的PCR产物在两条链的5’端引物部位含有dU，用 UDG 处理后，该区段被破坏，剩余的部分在后续的PCR循环中不能作为有效模板被扩增。 由于UDG对长于4核苷酸的DNA(单链或双链)所含的dU都能进行清除，所以在dU引物方案中需先将UDG灭活后再加入下一轮PCR的引物。
第四节 一个标准PCR实验的设计 第一步 设计引物 引物设计是否合理，是决定PCR反应成败的关键。一步走错，全盘皆错。所以，在这方面我们应多花点时间，可以避免以后少走弯路。 1）根据自己所要研究的基因，在Gene bank中找到相应的基因序列。 2）用Primer 5.0或Oligo 6.0 进行引物探针的设计。或者采用参考文献中的引物设计。 根据我的实验经验，最好参考国外的文献，等级越高可靠性越高。 （引物设计原则参见前面部分）
第二步、实验准备阶段 1）通过e-mail向公司提交引物合成申请单； 2）购买实验所需要的各种试剂或试剂盒以 及各种低值易耗品； 3）对实验所需的EP管、Tip头进行灭菌处 理（RNA提取和反应还需特别处理，请 参考《分子克隆》）；对引物参照说明 书进行稀释。 4）细读试剂盒说明书、熟悉操作步骤、制定 具体可行的操作方案。
第三步 实验操作阶段 基因组DNA、质粒DNA或总RNA的提取 用紫外分光光度计或荧光计检测DNA或RNA 的浓度、纯度，用琼脂糖凝胶检测是否降解 PCR（RT-PCR）反应 电泳检测PCR产物
第五节 聚合酶链式反应技术类型 1、 增效PCR 6、 RT-PCR 2、 热启动PCR 7、 PCR-VNTR 3、 降落PCR 8、 PCR-SSCP 4、 巢式PCR 9、 免疫-PCR 5、 多重PCR 10、PCR-ELISA … …
1、增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后，再以稀释后的初级PCR产物为模板进行次级扩增，靶序列的产量将会相应增加。
2、热启动PCR（Hot start PCR） 热启动是一种在PCR反应中优化目标扩增产物的方法， 同时也能抑制非特异产物的扩增。 它通过控制PCR反应的必须组分，如DNA聚合酶或镁离 子，直到反应混合物被加热到可以阻止非特异引导和引物聚 合的温度，才加入以上成分来启动PCR反应的一种方法。 在PCR反应第一个循环之前的加温步骤可去除并降低寡 核苷酸引物非特异性复性的可能性，而DNA聚合酶活性的缺 失则阻止了错配引物的延伸。
方 法 介 绍 1）升温后手工加酶：不方便、容易污染。 2）PE公司的蜡膜隔离法：更适用于不带热盖的PCR仪。如PE TC1、PE480。 3）单克隆抗体法：抗体与Taq酶结合抑制其活性。随 着温度的升高，抗体从酶上解离下来并在首轮PCR 循环的变性阶段被灭活，而酶的活性释放。此法适 用于各种PCR仪。 4）另一个改进方法：把Mg2+嵌入到蜡珠中，并随着 蜡的熔化而释放到反应混合液中 。
应 用 热启动PCR对于已优化的单个PCR反应没有必要。然而当非特异扩增较为严重时，热启动PCR就派上了用场。 例如当反应中的模板DNA少于10 个拷贝数 时，或当模板DNA复杂度非常高时（如哺乳动物基因组DNA），或当PCR包括几对寡核苷酸引物时， 即多重PCR (multiplex PCR) ，在这些情况下，热启动PCR和降落PCR结合有着很好的应用价值。 4
3、降落PCR（Touch Down-PCR） 降落PCR是一个很简单、实用的方法，当应 用新的引物和模板组合时，降落PCR是优化PCR最迅速的方法，当遇到诸如引导效率低，错误引 导和形成引物二聚体等问题时，降落PCR和热启 动PCR配合应用或加入GC-melt是解决问题的首选方法。
