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第四章 DNA 重组. DNA 分子内 或分子间发生遗传信息的重新组合,称为遗传重组 ( genetic recombination), 或者基因重排 ( gene rearrangement) 。重组产物 为重组体 DNA (recombinant DNA) 。DNA 的重组广泛存在于各类生物。真核生物基因间重组多发生在减数分裂 ( meiosis) 时 同源染色体之间的交换 ( crossover) 。细菌及噬菌体的. 基因组为单倍体,来自不同亲代两组 DNA 之间可通过 多种方式进行遗传重组 。
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第四章 DNA重组 DNA分子内 或分子间发生遗传信息的重新组合,称为遗传重组(genetic recombination),或者基因重排(gene rearrangement) 。重组产物为重组体DNA (recombinant DNA)。DNA的重组广泛存在于各类生物。真核生物基因间重组多发生在减数分裂(meiosis)时同源染色体之间的交换(crossover)。细菌及噬菌体的
基因组为单倍体,来自不同亲代两组DNA之间可通过多种方式进行遗传重组。 基因组为单倍体,来自不同亲代两组DNA之间可通过多种方式进行遗传重组。 DNA重组对生物进化起着关键的作用。生物进化是生物随时间发生变化和多样化的过程。生物进化以不断产生可遗传的变异为基础。首先有突变和重组,由此产生遗传的变异,然后才有遗传漂变(genetic drift)和自然选择(natural selection),才有进化。可遗传变异的根本原因是突变。然而,突变的机率很
低,而且多数突变是有害的。如果生物只有突变没有重组,在积累具有选择优势的突变同时不可避免积累许多难以摆脱的不利突变,有利突变将随不利突变一起被淘汰,新的优良基因就不可能出现。重组的意义在于,它能迅速增加群体的低,而且多数突变是有害的。如果生物只有突变没有重组,在积累具有选择优势的突变同时不可避免积累许多难以摆脱的不利突变,有利突变将随不利突变一起被淘汰,新的优良基因就不可能出现。重组的意义在于,它能迅速增加群体的 遗传多样性(diversity);使有利突变与不利突变分开(separation);通过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。
此外,DNA重组还参与许多重要的生物学过程。它为DNA损伤或复制障碍提供修复机制。某些生物的基因表达受DNA重组的调节。 此外,DNA重组还参与许多重要的生物学过程。它为DNA损伤或复制障碍提供修复机制。某些生物的基因表达受DNA重组的调节。 DNA重组包括同源重组(homologous recombination)、位点专一性重组(site-specific recombination)和转座重组(transposition recombination)等类型,以下分别介绍。
一、同源重组 同源重组又称一般性重组。同源重组发生在DNA的同源序列之间,真核生物非姊妹染色单体的交换,姊妹染色单体的交换,细菌及某些低等真核生物的转化,细菌的转导、接合等都属于这—类型。 Holliday对遗传重组的可能机制成功提出了一个模型予以说明。在分子水平上了解重组过程是在细菌的研究中加以解决的。
(一) Holliday模型 Robin Holliday于1964年提出一个模型,对于认识同源重组起了十分重要作用(图4-1)。在这一模型中,关键步骤有四个:①两个同源染色体DNA排列整齐;②一个DNA的一条链裂断并与另一个DNA对应的链连接,形成的连接分子(joint molecule),称为Holliday中间体(intermediate);③ 通过分支移动(branch migration)产生异源双链
(heteroduplex)DNA;④ Holliday中间体切开并修复,形成两个双链重组体DNA。切开的方式不同,所得到的重组产物 也不同。如果切开的链与原来断裂的是同一条链(见Holliday模型左边的产物),重组体含有一段异源双链区,其两侧来自同一亲本DNA,称为片段重组体(patch recombinant)。但如切开的链并非原来断裂的链(模型右边产物),重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA,称
为拼接重组体(splice recombinant)。 Holliday模型能够较好解释同源重组现象,但也存在问题。该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。DNA分子单链断裂是经常发生的事,但很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂。Meselson M和Radding C对此提出了修正意见,他们认为同源DNA分子中只有一个分子发生单链
DNA的重组 • 1.同源重组 • Holliday模型 图4-1 同源重组的Holliday模型两同源DNA分别以粗线和细线表示
DNA同源重组是一个十分精确的过程,哪怕只有一个核苷酸的差错都会造成基因失活。同源重组的分子基础是链间的配对,通过碱基配对才能找到正确位置,进行链的交换。当两同源DNA分子之一发生双链断裂,经核酸酶和解螺旋酶作用,产生具有3′末端的单链,它在另一DNA分子的同源区寻找互补链并与之配对。相对应的链则被置换出来,与原来断裂DNA同源重组是一个十分精确的过程,哪怕只有一个核苷酸的差错都会造成基因失活。同源重组的分子基础是链间的配对,通过碱基配对才能找到正确位置,进行链的交换。当两同源DNA分子之一发生双链断裂,经核酸酶和解螺旋酶作用,产生具有3′末端的单链,它在另一DNA分子的同源区寻找互补链并与之配对。相对应的链则被置换出来,与原来断裂
的链配对经修复合成和链的再连接,形成两个交叉,而不是单链交换时形成的一个交叉。值得注意的是,在两交叉之间,由交换和分支移动产生的是异源双链,而由修复合成产生的是同源双链(图4-2)。实验表明,两DNA分子必需具有75 bp以上的同源区才能发生同源重组,同源区小于此数值将显著降低重组率。
在不同生物体内同源重组的具体过程可以有许多变化,但基本步骤大致相同。同源性并不意味序列完全相同。两DNA分子只要含有一段碱基序列大体类似的同源区,即使相互间略有差异,仍然可以发生重组。同源重组是最基本的重组方式,它参与各种重要的生物学过程。复在不同生物体内同源重组的具体过程可以有许多变化,但基本步骤大致相同。同源性并不意味序列完全相同。两DNA分子只要含有一段碱基序列大体类似的同源区,即使相互间略有差异,仍然可以发生重组。同源重组是最基本的重组方式,它参与各种重要的生物学过程。复 制、重组和重组修复三个过程是密切相关
(二) 细菌的基因转移与重组 细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移,并通过基因重组以适应随时改变的环境。这种遗传信息的流动不仅发生在种内,也发生在种间,甚至与高等动植物细胞之间也存在横向遗传传递(horizontal genetic transmission)。
例如,从人体内寄生的细菌基因组中可以找到确定属于人类的基因。被转移的基因称为外基因子(exogenote),如果与内源基因组或称内基因子(endogenote)的一部分同源,就成为部分二倍体(partial diploid),这种情况下可以发生同源重组。细菌的基因转移主要有四种机制:接合(conjugation)、转化
(transformation)、转导(transduction)和细胞融合(cell fusion)。进入受体细胞(recipient cell)的外源基因通常有四种结果:降解、暂时保留、与内源基因置换和发生整合。 1细菌的接合作用 细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞,称为
接合作用。供体细胞被定义为雄性,受体细胞为雌性。通过接合而转移DNA的能力是由接合质粒(conjugative plasmid)提供的,与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子(fertility facter),简称为性因子或F因子。大肠杆菌F质粒(F因子)是研究得最多,也是研究得最清楚的一种接合质
粒。F质粒是双链闭环的大质粒,总长约100 kb,复制起点为oriV。F质粒可以在细胞内游离存在,也可以整合到宿主染色体内,因此属于附加体(episome)。其与转移有关的基因(tra)占据质粒的三分之一(~33 kb),称为转移区,包括编码F性菌毛(F pilus)、稳定接合配对、转移的起始和调节等,总共约40个基因。
2细菌的遗传转化 遗传转化(genetic transformation)是指细菌品系由于吸收了外源DNA(转化因子)而发生遗传性状的改变现象。具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞(competent cell)。很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA的能力(如固氮菌、链球菌、芽孢杆菌、奈氏球菌及嗜血杆菌等),虽然感受态
经常是瞬时的,与特定的生理状态有关。转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低,但在实验室中可以人工促使转化。例如大肠杆菌,用高浓度Ca2+处理,可诱导细胞成为感受态,重组质粒得以高效转化。人工转化的机制目前还不十分清楚,可能与增加细胞通透性有关。经常是瞬时的,与特定的生理状态有关。转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低,但在实验室中可以人工促使转化。例如大肠杆菌,用高浓度Ca2+处理,可诱导细胞成为感受态,重组质粒得以高效转化。人工转化的机制目前还不十分清楚,可能与增加细胞通透性有关。
3细菌的转导 转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。转导有两种类型:普遍性转导(generalized transduction),是指宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌;局限性转导(specialized transduction),某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主
4细菌的细胞融合 在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验室中,用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖,使之成为原生质体,可人工促进原生质体的融合,由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。
(三) 重组有关的酶 已经分离并鉴定了原核生物和真核生物促进同源重组各步骤有关的酶,研究最多的还是大肠杆菌的酶。在大肠杆菌中,RecA蛋白参与重组是最关键的步骤。 RecA有两个主要的功能:诱发SOS反应和促进DNA单链的同化(assimilation)。所谓单链同化即是指单链与同源双链分子发生链的交换,从而使重组过程中DNA
配对、Holliday中间体的形成,分支移动等步骤得以产生。当RecA与DNA单链结合时,数千RecA单体协同聚集在单链上,形成螺旋状纤丝(helical filament)。RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸。 RecA蛋白相对分子质量为38000,它与单链DNA结合形成的螺旋纤丝每圈含六个单体,螺旋直径10nm,碱基间距0.5nm。
此复合物可以与双链DNA作用,部分解旋以便阅读碱基序列,迅速扫掠寻找与单链互补的序列。互补序列一旦被找到,双链进一步被解旋以允许转换碱基配对,使单链与双链中的互补链配对,同源链被置换出来(图4-3)。链的交换速度大约为6 bp/s,交换沿单链5′→3′方向进行,直至交换终止,在此过程中由RecA水解ATP提供反应所需能量。
图4-3RecA蛋白介导的DNA链交换模型 A:DNA链交换的侧面观: 1.RecA蛋白与单链DNA结合;2.复合物与同源双链DNA结合;3.入侵单链与双链中的互补链配对,同源链被置换出来; B:DNA链交换过程RecA蛋白的横切面
任何部位的单链DNA都能借助RecA蛋白与同源双链DNA进行链的交换。单链DNA可以由许多途径产生,RecBCD酶是产生参与重组的DNA单链主要途径。该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。Rec BCD酶具有三种酶活性:① 依赖于ATP的核酸外切酶活性,② 可被ATP增强的核酸内切酶活性,③ ATP依赖的解螺旋酶活性。当DNA分子断裂时,它即结合
在其游离端,使DNA双链解旋并降解,解旋所需能量由ATP水解供给。及至酶移动到chi位点(5′GCTGGTGG3′),在其3′侧4~6个核苷酸处将链切开,产生具有3′末端的游离单链。随后单链可参与重组各步骤。大肠杆菌基因组共有1009个chi位点,分布在DNA各部位,平均5kb有一个,成为重组热点。在其游离端,使DNA双链解旋并降解,解旋所需能量由ATP水解供给。及至酶移动到chi位点(5′GCTGGTGG3′),在其3′侧4~6个核苷酸处将链切开,产生具有3′末端的游离单链。随后单链可参与重组各步骤。大肠杆菌基因组共有1009个chi位点,分布在DNA各部位,平均5kb有一个,成为重组热点。
由于DNA分子具有螺旋结构,在持续进行链的交换时需要两DNA分子发生旋转。RecA能够介导单链绕入另一DNA分子,并水解ATP。一旦Holliday中间体形成,即由RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成。RuvA蛋白能够识别Holliday联结体(junction)的交叉点,RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象,使得分支点易于移动,RuvA还帮助RuvB六聚体环结合在双链DNA上,位于交叉点上游。 由于DNA分子具有螺旋结构,在持续进行链的交换时需要两DNA分子发生旋转。RecA能够介导单链绕入另一DNA分子,并水解ATP。一旦Holliday中间体形成,即由RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成。RuvA蛋白能够识别Holliday联结体(junction)的交叉点,RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象,使得分支点易于移动,RuvA还帮助RuvB六聚体环结合在双链DNA上,位于交叉点上游。
RuvB是一种解螺旋酶,通过水解ATP而推动分支移动(图4-4)。RuvAB复合物的移动速度约为10~20 bp/s。同源重组最后由RuvC将Holliday联结体切开,并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。 RuvC是一种核酸内切酶,特异识别Holliday联结体并将其切开。它识别不对称的四核苷酸ATTG,此序列因而成为切开Holliday联结体的热点,并决定
结果是片段重组还是拼接重组,即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子。 相当于原核生物中与重组有关酶的对应物也已在真核生物中发现。在酿酒酵母中的rad51基因与大肠杆菌recA基因同源,二者的功能有关。该基因突变造成双链断裂积累,并且无法形成正常的联会复合物,但此蛋白质不能在体外与单链DNA形成纤丝,表明原核生物与真核生物的同源重组机制可能有所不同。
二、 特异位点重组 特异位点重组广泛存在于各类细胞中,起着十分特殊的作用,彼此有很大的不同。它们的作用包括某些基因表达的调节,发育过程中程序性DNA重排,以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。此过程往往发生在一个特定的短的(20~200 bp)DNA序列内(重组位点),并且有特异的酶(重组酶)和辅助
因子对其识别和作用。特异位点重组的结果决定于重组位点的位置和方向。如果重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上,重组结果发生倒位。重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上,重组发生切除;在不同分子上,重组发生整合(图4-5)。因子对其识别和作用。特异位点重组的结果决定于重组位点的位置和方向。如果重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上,重组结果发生倒位。重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上,重组发生切除;在不同分子上,重组发生整合(图4-5)。
图4-5特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向重组位点以白箭头表示。A重组位点反方向位于同一DNA分子,重组结果发生倒位。B重组位点同方向位于同一DNA分子,重组发生切除;位于不同分子,重组发生整合图4-5特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向重组位点以白箭头表示。A重组位点反方向位于同一DNA分子,重组结果发生倒位。B重组位点同方向位于同一DNA分子,重组发生切除;位于不同分子,重组发生整合
位点专一性重组最早是在λ噬菌体的遗传学研究中发现的。λDNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的专一性位点上,转变成为原噬菌体DNA的非活性状态。一般位点专一性重组都具有λ整合作用的两个基本特征:①交换是相互的和保存原先的DNA,是典型的保守性重组(conservative recombination);②它发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列
中的专一性核苷酸上,在高等生物细胞中,最重要的例子是通过一组前体序列的位点专一性重排构建多种多样的专一抗体基因。本节简要介绍噬菌体DNA的整合与切除。中的专一性核苷酸上,在高等生物细胞中,最重要的例子是通过一组前体序列的位点专一性重排构建多种多样的专一抗体基因。本节简要介绍噬菌体DNA的整合与切除。
λ噬菌体的整合与切除 λ噬菌体侵入大肠杆菌细胞后,面临着裂解生长还是溶源生长两种生活型的选择,其DNA在不同生活型之间的转换包括两种状态:进入溶源状态需要λDNA整合(integrate)进宿主DNA,噬菌体DNA是细菌染色体的整合部分;由溶源状态进入裂解状态需要λDNA从宿主DNA上切除(excise)下来,λDNA在宿主细菌中
以环状分子独立存在。这里,整合和切除均通过细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组而实现。这些特定位点叫附着位点(attachment site或att)。细菌的附着位点称attB,由序列B、O和B’组成,噬菌体的附着位点称attP,由序列P、O和P’组成。其中B、B’、P、P’的序列各不相同,而O序列是attB和attP所共有的,图4-15说明在这些位点处发生的重组反应。
噬菌体DNA attP POP’ + BOB’ 细菌DNA attB 整合 Int IHF Int 切除 Xis IHF BOP’ attL POB’ attR 原噬菌体DNA 图4-15 λ噬菌体的位点专一性重组
由于噬菌体DNA是环状的,在重组过程中,它以线性形式插入细菌染色体中,此时原噬菌体被重组产生的两个新att位点所固定。所以,形成这两个新的附着位点attL(BOP’)和attR(POB’)是很重要的,这样可以使整合和切除反应不在一对相同的反应序列之间发生。整合过程要求在attB和attP之间进行识别,而
切除过程则在attL和attR之间识别。因此,位点专一性重组反应的定向特征取决于重组位点的识别。尽管重组反应是可逆的,但反应导向则由不同条件决定,这是噬菌体生活过程的重要特征,因为它保证了整合反应不会立即被切除反应所逆转。反之亦然。
三、 转 座 重 组 转座因子(transposable element)是一种可以由染色体的一个位置转移到另外位置的遗传因子,也就是一段可以发生转座(transposition)的DNA,又称为转座子(transposon)。转座的位置通常或多或少是随机的。当转座子插入一个基因内时,该基因即失活,如果是重要的基因就可能导致细胞死亡。因此转座
早在20世纪40年代,美国遗传学家McClintock B在研究玉米的遗传因子时发现,某些基因活性受到一些能在不同染色体间转移的控制因子(controlling element)所决定。这一发现与当时传统的遗传学观点相抵触,因而不被学术界所普遍接受。直到60年代后期,美国青年细菌学家Shapiro J在大肠杆菌中发现一种由插入序列
(insertion sequence,IS)所引起的多效 突变,之后又在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子,才重新引起人们重视。1983年McClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖,距离她公布玉米控制因子的时间已有32年之久。
(一) 细菌的转座因子 细菌的转座因子有两类:一类为插入序列(IS),是简单的转座子,除转座所需基因外不携带任何标记基因,它的存在只能借助插入位点有关基因的失活来判断,或者通过分子杂交和测序来检测。