1 / 22

Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo el ő fordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakulj

Rekombináns fehérjék termeltetési stratégiái. Két f ő stratégia: . Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo el ő fordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakuljanak ha a fehérje mérgez ő a gazdasejtre, akkor el ő ször inaktív fehérjét állítunk el ő ,

tamma
Télécharger la présentation

Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo el ő fordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakulj

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Rekombináns fehérjék termeltetési stratégiái Két fő stratégia: • Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo előfordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakuljanak • ha a fehérje mérgező a gazdasejtre, akkor először inaktív fehérjét állítunk elő, majd ezt aktiváljuk, ehhez kell az in vitro “refolding” Az aktív forma esetén “csak” tisztítani kell a fehérjét

  2. REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK AKTÍV FORMÁBA VITELE Három fő lépés: 1. Az oldhatatlan “inclusion body”-t szolubilizáljuk, alacsony vagy magas pH, emelt hőmérséklet, detergensek, magas koncentrációjú szervetlen sók, vagy szerves oldószerek. A legelterjedtebbek: urea, vagy guanidin-hidroklorid, esetleg redukálószer (pl. DTT) jelenlétében. 2. Refolding híg fehérje oldattal - ha nincs diszulfid híd, akkor a fehérje denaturálószer lassú eltávolítása - ha diszulfid hidak vannak, akkor a renaturáció mellett a diszulfid hidakat is ki kell alakítani, szerkezet stabilizáló hatásuk van. levegőztetés, tiol-diszulfid párok hozzáadása, pH optimalizálása 3.Az aktív és inaktív forma szétválasztása pl. affinittás kromatográfia, preparatív SDS-PAGE, RP-HPLC, FPLC stb.

  3. trp promoter alapú vektorok - alaposan vizsgált, jósolható eredmény - erős, 2-30% a rekombináns/összfehérje - alapállapotban alacsony expresszió, de toxikus fehérjékre ez nem elég, pBR322 vektorban kb 50x-es indukció - majdnem minden E. coli sejtvonalban használható - magas kópiaszámú plazmidok nem használhatók, nincs elég trp represszor Probléma: triptofán elvonás az indukció – egy kissé nehézkes

  4. Kétkomponensű trp alapú expressziós rendszer Invitrogen ptrpcI Kromoszómán integrálva

  5. T7 RNS polimeráz alapú vektorok - T7 promoter nagyon szelektív, a gazdában nincs ilyen promoter általában - T7 RNS polimeráz 5x gyorsabb, mint az E. coli-é, azaz már a transzkript is domináns Gazdasejtek: Standard klónozó vektorok klónozásra BL21 (F-, ompT-, lon-) expresszióra, lizogén sejtváltozatok: DE3 bakteriofág, immunitási régió, lacI gén, lacUV5 promoter lacZ eleje + T7 RNS polimeráz génje,integrálva kromoszómába Nagyon toxikus fehérjék esetén pLysS, pLysE T7 lizozim: természetes inhibitora a T7 RNS polimeráznak, E.coli tudja tolerálni, mert nem képes áthatolni a belső membránon pACYC184 vektorba van beépítve, catr, kompatibilis vektor pLysE nagy mennyiséget, pLysS kevesebb mennyiséget termel (ellentétes orientáció, tet promoter CE6 bakteriofág  tartalmazza a T7 RNS polimeráz génjét, így az indukció kívülről bejuttatott gén

  6. kromoszóma lacUV5 int lacI lacZ T7 RNS polimeráz int 10 vagy T7/lac Prom. RBS termeltetendõ fehérje génje vektor bla ORI A pET vektorokon alapuló, indukálható fehérje termelés elvi sémája

  7. A pET rendszer

  8. pET vektorok • pBR322 származékok, • ampicillin, vagy kanamicin rezisztensek • 10 promoter, a T7 fág 10-es génjének (kapszid) erős promótere 1. Transzkripciós vektorok T7 promoter van, de nincs transzlációs iniciációs szignál különféle verziók, stop szignálok bevitele vagy sem, fúziós partner esetleg a C terminálison Visszaszorulóban vannak T7lac promoteres változatok Nagyon toxikus fehérjék esetén dupla biztosítás: a T7 promotertől startpont környékére a lac operátor szekvencia klónozása, elegendőlacI biztosítása, a vektorba beépítették ellentétes irányban

  9. Két transzkripciós vektor példa

  10. Transzlációs vektorok • 10 transzkripciós és transzlációs szignálok, • mindegyik típusú egy sorozat különböző leolvasási keretekkel • Egy rövid fúzió az első 10 aminosavval (g10),de NdeI-gyel elkerülhető.  • Esetenként  206aa fúzió  stabilitás

  11. Plazmid stabilitási teszt   lemezek: ampicillin, IPTG, mindkettő és egyik sem Mik nőnek fel? 1. egyik sem: minden sejt 2. ampicillin: plazmid tartalmú sejtek, 3. IPTG: plazmid mentes sejtek, vagy expressziós mutánsok 4. IPTG, amp.: plazmid marad, de az expressziós készség elveszett

  12. ptac alapú vektorok: pGEX sorozat GST: mindig N-terminális fúzióelvileg szolubilizál Nem lehet denaturáltan tisztítani

  13. Arabinóz alapú expressziós vektorok Vektor felépítés Szabályozás Szekréciós vektor Kontrollálhatóság

  14. Fehérje termeltetés in vitro In vitro transzláció • Előnyei: • Oxidatív környezet • Citotoxicitás elkerülése, farmakológiai alkalmazások • Nincs membrán, a termék azonnal a reaktortérbe kerül • gyors • Hátrányai: • Drága • Kitermelés korlátozott Két fő stratégia RNS polimerázzal +sejt extraktummal Tiszta komponensekből

  15. Az in vitro fehérjetermeltetés folyamatábrája

  16. T7 alapú rendszerek

  17. Az igazán in vitro rendszer

  18. ATGGAACGCCGCTATTGCCATCGCATTAGCACCATGGCGAGCGCGAACGATCATGCGCCGCCGTATAACGAATGGTATGAAGCGCGCTAA

  19. MERRY CHRISTMAS AND HAPPY NEW YEAR 1 atggaacgccgctattgccatcgcattagcaccatggcgagc m e r r y c h r i s t m a s gcgaacgat a n d catgcgccgccgtataacgaatggtatgaagcgcgctaa h a p p y n e w y e a r -

More Related