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免疫学的临床应用

免疫学的临床应用. 免疫诊断 免疫治疗 免疫预防. 免疫学诊断. 利用免疫学原理建立的免疫学检测 技术主要应用于对多种免疫性疾病（感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应和肿瘤等）的诊断、疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原性物质或免疫细胞的定性、定量，对细胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。. 免疫学诊断. 免疫学诊断. 一、抗原或抗体的检测. 二、淋巴细胞的测定. 三、免疫学检测方法的应用. 免疫学诊断. 一、抗原或抗体的检测. （一）抗原抗体反应的原理. 1 、抗原抗体反应的 特异性 （ 1 ）特异性：基于两 种分子间

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Presentation Transcript

  1. 免疫学的临床应用 • 免疫诊断 • 免疫治疗 • 免疫预防

  2. 免疫学诊断 • 利用免疫学原理建立的免疫学检测 技术主要应用于对多种免疫性疾病（感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应和肿瘤等）的诊断、疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原性物质或免疫细胞的定性、定量，对细胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。 免疫学诊断

  3. 免疫学诊断 一、抗原或抗体的检测 二、淋巴细胞的测定 三、免疫学检测方法的应用 免疫学诊断

  4. 一、抗原或抗体的检测 （一）抗原抗体反应的原理 1、抗原抗体反应的 特异性 （1）特异性：基于两 种分子间 的结构互补性和亲和性。 （2）可逆性 （3）适宜的条件：电解质、pH、温度等 免疫学诊断 2、抗原抗体反应的可见性 抗原抗体按适当比例结合，形成肉眼可见的现象。

  5. 抗原抗体反应的特点 • 特异性 • 可逆性 • 阶段性 • 可见现象

  6. 抗原抗体结合的特异性 • 抗原分子上的表位和抗体分子V区中的超变区互相适应所决定的。 • -交叉反应(cross reaction)：多数的天然抗原物质,如微生物抗原,常具有多个不同的表位,如果两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的表位，则与抗体血清反应时可出现交叉反应。

  7. Anti-A Ab Anti-A Ab Anti-A Ab Ag C Ag A Ag B Shared epitope Similar epitope Cross reactions

  8. 抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合(可逆性)抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合(可逆性) -结合力的大小取决于两分子间由氢键、疏水键、静电引力和范德华力(Van der waal's force)组成的引力与电子云产生的排斥力相抵消后的合力。 - 抗原表位和抗体分子可变区之间互补的构形造成两分子之间有较强的结合力,但在一定条件下,可发生解离, 解离后的抗原和抗体性质不变。

  9. 抗原抗体反应可分为两个阶段 (阶段性) 1 抗原抗体特异性结合阶段： 此阶段需时短,仅需几秒到几分钟,无可见 反应出现; 2 可见反应阶段： 需时较长,数分,数小时或数日出现可见现象,表现为沉淀,凝集,细胞溶解等。

  10. 抗原和抗体结合可出现明显可见的 反应现象 两者的分子比例密切相关。(适宜比例)

  11. 抗体过剩带：抗原不足，上清可检测到抗体 l等 价 带： 抗原充足，结合所有的抗体，比例合 适，上清检测不到抗原或抗体 l抗原过剩带： 抗原过剩，抗体结合量小，由于过 剩的抗原导致可溶性的抗原－抗体 复合物的形成

  12. 抗原抗体反应受多种因素影响 • 电解质: • 温度: • 酸碱度 • 抗原抗体适宜浓度 抗原-抗体反应受多种因素影响

  13. 电解质 在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负电荷, 适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝集现象。若无电解质存在,则不发生可见反应,通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液,以供给适当浓度的电解质。

  14. 温 度 适当提高反应时的温度,以增多抗原抗体分子碰撞的机会,可加速复合物体积增大,反应现象出现快。但过高温度(超过56℃)将会使抗体或抗原变性或破坏。一般常使反应在37℃水浴中进行。

  15. 酸碱度 抗原抗体反应适宜的PH值为6-8,PH值过高或过低能直接影响抗原抗体的理化性质,可引起非特异性酸凝集,造成假象,影响反应的可靠性。

  16. 应 用 1、利用已知抗原检测未知抗体 （1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病： 伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。 （2）检测自身抗体——诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等 2、利用已知抗体检测未知抗原 （1）鉴定病原菌：诊断疾病 （2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌 （3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定 （4）检测药物半抗原： 确认运动员是否服用兴奋剂

  17. （二） 抗原或抗体的检测方法 • 凝集反应 • 沉淀反应 • 补体参与的抗原抗体反应 • 免疫标记技术

  18. （一）凝集反应（agglutination） 颗粒性抗原（红细胞、细菌、 乳胶颗粒等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。 1 、直接凝集(direct agglutination) 玻片凝集、试管凝集 2、间接凝集（indirect agglutination） 可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应 抗 体混合出现的凝集现象。 3、抗球蛋白试验（Coombs试验） 抗原与单价抗体（不完全抗体）结合不出现凝集块，再 加入抗球蛋白后即形成凝集块。 用于检测抗Rh抗体以诊断新生儿溶血性贫血。

  19. 直接凝集反应 (direct agglutination) 概念: 颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的凝集现象，如红细胞凝集或细菌凝集。 分类： 玻片法：定性试验、方法简便快速，用于菌种鉴定及人ABO血型鉴定 试管法：半定量试验，常用于抗体效价的测定，诊断伤寒或副伤寒的肥达氏反应(Widal test)、诊断布氏菌病的瑞特氏反应(Wright test)

  20. 间接凝集反应 indirect agglutination

  21. 间接(被动)凝集反应 (indirect/passive agglutination)

  22. 载体颗粒 • 红细胞（O型人红细胞，羊红细胞及兔红细胞）→间接血凝实验 • 聚苯乙烯乳胶颗粒→间接乳胶凝集试验 • 活性碳→间接碳凝集试验

  23. 直接凝集 间接凝集 红细胞 乳胶颗粒 类风湿因子检测 妊娠试验

  24. （二）沉淀反应（precipitation） 可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合， 形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。可分为单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳、免疫比浊法等。 免疫比浊法：快速简便。用于血清IgG、IgA、IgM、 补体C3、C4含量测定

  25. 单向免疫扩散试验 • 概念及原理: 适宜浓度的抗体预先在琼脂中混匀后制成琼脂凝胶板，以适当距离打孔，将可溶性抗原至孔中，抗原向周围扩散，与琼脂中抗体相遇，开始时形成可溶性的抗原－抗体复合物（抗原过量）当更多的抗原到达，与抗体比例适宜时，出现晶格和沉淀。沉淀环的直径与孔中抗原浓度呈正相关，可根据沉淀环直径大小从预先绘制成的标准曲线查出待测标本中抗原含量。本试验方法简单，容易观察结果，可测定抗原的灵敏度约为10～20μg／ml. • 应用: 常用于人或动物血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量检测。缺点需要经1～2天结果。

  26. 单向免疫扩散(singleradialimmunodiffusion

  27. 双向免疫扩散(double immunodiffusion) 加入定量的抗体在中间孔，按一定距离在四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的抗原可见粗细不等的沉淀线，从而可判定抗原的效价。

  28. 常用于检测两种抗原的相关性 定性实验

  29. 对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis) 概念:在电场中进行的双向免疫扩散。 原理:将抗原加至近阴极孔内，抗体加至近阳极孔内。抗原与抗体在pH 8.6的缓冲液中均带负电荷，通电后，抗原因带负电荷向阳极泳动，而抗体球蛋白等电点高，所带负电荷少，加之分子量较大，向阳极的位移小于受电渗作用向阴极的位移，表现为向阴极泳动，形成抗原抗体相向移动，二者结合，在比例适宜处形成白色沉淀线。 优点:本法比双向免疫扩散出结果快，只需1小时左右，灵敏度亦提高，约为10μg／ml。 电渗：电场中溶液相对于固体的移动。琼脂是酸性物质，在碱性溶液中带负电，而与它接触的溶液带正电，因此液体向阴性移动。抗原抗体进行对流，在比例合适处形成沉淀线。

  30. 对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis)

  31. 免疫电泳（Immunoelectrophoresis) • 是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。

  32. 火箭电泳 （Rocket Electrophoresis) 火箭电泳也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。

  33. 火箭电泳示意图

  34. 补体 （三）补体参与的抗原抗体反应 试验原理？ 1、50 %补体溶血试验（CH50测定） ——血清总补体量测定 2、补体结合试验(complement fixation test)：检测抗原或抗体。 原理：用已知的指示系统检测试验系统是否结合补体进行诊断 检测系统：待测样品和已知抗原（或抗体） 指示系统：SRBC和溶血素 溶血—阴性；不溶血—阳性

  35. 补体结合反应 （Complement Fixation, CFT) 敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。

  36. （四）免疫标记技术 用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性 酶：辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶 放射性同位素： 125I、131I 荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（红色荧光） 免疫荧光检测法（IFA） 酶免疫检测法（EIA） 放射免疫检测法（RIA） 液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）

  37. 免疫荧光技术 间接荧光法 直接荧光法

  38. 间接免疫荧光法示意图

  39. 免疫荧光显微技术

  40. 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA法） • 间接法 • 双抗夹心法 • 竞争法 E: 辣根过氧化酶 HRP S: 底物 二氨基联苯胺 DAB/邻苯胺

  41. 间接法 DAB

  42. 双抗夹心法 DAB

  43. BAS-ELISA法（biotin-avidin-system，生物素-抗生物素系统-ELISA法）：敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测。 卵白及某些微生物中的蛋白质

  44. BAS-ELISA(biotin-avidin system,BAS-ELISA)。 这是在ELISA中引入一个放大系统。生物素（biotin）是广泛存在于生物组织中的一种生长因子，亲和素（avidin）是从卵白中提取的一种蛋白质，也可从链霉菌培养滤液中提取链霉亲和素（streptavidin）。亲和素或链霉亲和素能与多个生物素分子结合，抗原或抗体分子又可偶联多个生物素，亲和素可大量结合抗体及酶，从而起到多级放大作用。该法具有灵敏、简便、快速的优点。

  45. 酶联免疫斑点法（Enzyme-Linked Immunospot, ELISPOT) 是在ELISA的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。

  46. 加入淋巴细胞 加入淋巴细胞 CK 抗原包被的反应板 加入酶标记二抗 CK抗体包被的反应板 加入酶标的CK抗体 加入底物 加入底物 T细胞产生CK的检测 检测抗原特异性B细胞

  47. 免疫酶染色 原理：又称免疫组化技术（immunohistochemistry technique）其原理与免疫荧光法相似，不同之处是在于用酶标记抗体，称酶标抗体。酶标抗体与抗原发生特异性结合，加入底物后，底物受酶的催化发生组织化学反应产生有色物质。 酶：辣根过氧化物酶(horseradish perroxidase,HRP)：底物为二氨基联苯胺(DAB)，可生成棕褐色沉淀物。 用途：主要用于检测细胞内、组织内的抗原（定位和定量）。

  48. 放射免疫检测法（RIA） 灵敏度达pg水平。常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及IgE等。 竞争法

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