Lezione 9-10 10-XI-06

1. Lezione 9-10 10-XI-06 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ - Per nome del gene, della funzione, di una struttura o di un elemento o di un dominio funzionale - Per sequenza con un frammento, con una struttura o un elemento corrispondente ad una regione con una funzione specifica, - per omologia a domini funzionali Cercare le sequenze in banca dati

2. Amplificazione del DNA Blastn con primers noti sequenze dei DNA corrispondenti agli ampliconi A che ci serve amplificare tramite PCR delle sequenze di DNA note? • - per sequenziarle, se ci si aspettano mutazioni o polimorfismi • per usarle come sonde (ibridaz. South. North. In-situ) • per trasformare delle cellule (costrutti con funzioni specifiche da esprimersi nelle cellule) • per clonarle • per mutagenizzarle • per preparare dei costrutti, • per fare diagnostica e per n + 1 scopi

3. Differenze tra Southern, Northern e PCR Tramite analisi Southern si determina il peso (lunghezza) dei frammenti di restrizione su cui ibridano le sonde (marcate) Tramite analisi Northern si determina la presenza e la lunghezza di RNA trascritti, poliadenilati e non, contenenti la sequenza della sonda Tramite PCR si ottiene un amplificato corrispondente all’amplicone compreso tra i due primers prescelti, selezionati, disegnati secondo i criteri che vedremo in seguito

4. DNA was isolated from several clinical samples using Gentra's PUREGENE DNA Isolation Kit and electrophoresed through a 0.7% gel at 60V for 2hr. DNA size marker Lambda digested (lane 1 Hind III; lane 8 BstE2), DNA isolated Parentesi I from human whole blood (lane 2), bone marrow (lane 3), buffy coat (lane 4), clotted blood (lane 5), cultured cells fixed in 70% ethanol (lane 6) and muscle (lane 7) digested with EcoRI.

5. negli eucarioti gli mRNA sono stabilizzati (polyadeniltati), essendo solo ~ il 5% se si cerca un messaggero poco espresso conviene eliminare il rRNA Parentesi II In questa figura dopo ibridazione con la sonda specifica di un gene non si vede differenza tra la corsia dell’ mRNA arrichito ed RNA totale

6. Altre possibili applicazioni della PCR - Oltre all’amplificazione diretta del DNA si può fare RT-PCR tramite reverse transcriptase da mRNA RT-PCR è il metodo per determinare l’espressione o meglio la trascrizione di un gene - alternativa all’analisi Northern ma non determina la lunghezza del mRNA, solo la presenza e volendo la quantità trascritta

7. Altre possibilità di analisi tramite PCR • perfezionamenti delle tecniche e degli enzimi • - nuove macchine con determinazione in tempo reale (real-time PCR) tramite laser (light-cycler) del DNA o cDNA amplificato proporzionale al templato iniziale presente nel campione in analisi. • Questa è la PCR quantitativa, diversa dalla PCR semiquantitativa o competitiva.

8. PCR “polymerase chain reaction” La reazione a catena della DNA polimerasi Descrizione della tecnica, metodo, componenti, variabili, strumenti = termociclatori Tecnica: amplificazione esponenziale a cicli successivi tramite DNA polimerasi (adesso e’ termo resistente) DNA polimerasi di “thermophilus aquaticus” (Taq polimerasi) - salto di qualita’ del metodo, molto piu’ efficiente. Le applicazioni si sono moltiplicate nella ricerca biologica e medica, nella diagnostica e medicina forense (legale) Il principio sfrutta l’efficienza (velocita’ di sintesi) della DNA polimerasi utilizzando due inneschi (primers) artificiali scelti dallo sperimentatore sulla sequenza da amplificare (modo esponenziale).

9. Ricordare per sempre: Le polimerasi sintetizzano DNA o RNA in direzione 5’ 3’ a partire da un innesco 3’ libero su un templato. Il DNA e’ una molecola a doppia elica, le due eliche sono antiparallele, la sintesi avviene sempre nella stessa direzione per ognuna delle eliche, quindi in verso opposto su ognuna di esse, ma sempre 5’ 3’ La polimerasi poiche’ sintetizza in direzione 5’ 3’ scorrera’ sulla elica di DNA templato in direzione 3’ 5’ Come sintetizza la polimerasi

10. Come si fa la PCR, in cosa consiste Reazione a Catena di Polimerizzazione RCP PCR • amplificazione tramite sintesi de-novo di nuovi filamenti di DNA da parte della DNA polimerasi di Thermophilus aquaticus • - definizione: reazione ad amplificazione esponenziale con un raddoppio teorico della quantità di DNA ad ogni ciclo di sintesi. • La DNA polimerasi di cosa ha bisogno ? • - del templato denaturato a singolo filamento (forca replicativa?) • dei primers (inneschi) • dei nucleotidi per la sintesi • del tampone • del Magnesio

11. Il ciclo (non il velocipede) Primer frw. = seq + Denaturazione + 5’ 3’ _ 2 eliche Primer rev. = seq - 3’ 5’ Annealing a ~ 50°- 60° C pr. rev. 5’ 3’ pr. frw. 3’ 5’ Extension (Polimerizzazione) 3’ 5’ 3’ 5’ I CICLO 5’ 3’ 3’ 5’ Denaturazione 5’ 3’ 4 eliche 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’

12. Ciclo continuo 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ II CICLO 4 eliche 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Denaturazione 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 8 eliche 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ IV ciclo III CICLO 32 eliche….. 16 eliche Annealing Extension (Polimerizzazione) La crescita e’ esponenziale : teoricamente ad ogni ciclo un raddoppio di DNA, ma dipende dalla messa a punto del protocollo di reazione, molte variabili da ottimizzare - senza contaminazioni amplificazione da quantita’ minime di DNA (famtogrammi o singole cellule) - genoma diploide 2 doppie eliche di templato in interfase

13. vanno determinate per i tempi, temperature e quantita’(conc.) ogni ciclo = 3 passaggi (fasi) I passaggio denaturazione (5-10 min. quella iniz. della reazione) II passaggio appaiamento dei primers (annealing) III passaggio di sintesi del DNA, estensione del filamento di DNA a partire dai primers (inneschi) Fine del ciclo Alla fine dei cicli programmati viene fatta una estensione di 5 -10 min. per assicurare il completamento della sintesi di tutti i nuovi frammenti iniziati e non terminati Le condizioni di reazione di ogni passaggio

14. Volume di reazione: da 10 a 50 ml (max 100 l) per una preparativa. Il DNA, abbastanza pulito, non deve essere purissimo, la quantita’ puo’ essere molto poca, normamlmente si usano 10-100 ng di un genoma eucariotico, più di 500 ng possono inibire della reazione La Taqpolimerasi, DNA polimerasi di “thermophilic eubacterium thermus acquaticus” resiste a 95°, frequenza di errore superiore a quelle di eucarioti, 26 x10- 6, ora ce ne sono per diverse finalita’, a basso tasso di errore = high fidelity 8.5 x10- 6, e per frammenti lunghi genomici. Se ne usa da meno di 1U fino a 5 U, ma se si fanno molti cicli conviene spezzare la reazione in due fasi e riaggiungerla dNTPs:conc. standard 100 M per ognuno Il tampone:sale di Tris, il Mg concentrazione empirica tra 0. 5 mM e 4. 5 mM, ogni Taq pol. ha un tampone con concentrazioni saline (buffer) ideali I primers:scelti per funzionare in coppia, evitare GC ed AT finali, palindromi, sequenze complementari, devono avere TM(melting) simili, H2O q.b. sterile incontaminata per arrivare al volume finale Le componenti per la reazione:

15. Fasi del ciclo, passaggi I denaturazione,a 94°- 95°C, il Tempo a seconda della lunghezza del frammento da amplificare. Prima del I ciclo si tiene a 95°C per qualche min. per la denaturazione completa del DNA templato genomico. Cicli successivi meno si tiene ad alta temperatura e meno si compromette l’attivita’ della Taq. Polimerasi 92°- 96° II Temp. di “annealing”(appaiamento dei primers) Dipende dalla lunghezza dei primers e dal contenuto in GC/AT (~3 gradi GC/ ~2 gradi AT) dipende anche dalla concentrazione salina di NaCl e dal pH, ci sono programmi che la calcolano con un algoritmo. La conc. finale dei primers di solito e’ 15 pmoli. La temperatura si tiene circa 4-10 gradi sotto la TM (Temp.Melting = 100% di denaturaz.) III Extension,temperatura ottimale di sintesi della Taq polimerasi 72°C. Si usa ~1 unita’ di enzima per reazione, se il frammento e’ corto se ne puo’ usare 1/2; se il frammento e’ lungo e il ciclo e’ lungo o ci sono molti cicli, si usano piu’ unita’. Si puo’ spezzare la reazione in due e riaggiungere Taq. Alcune Taq sono più attive vanno calibrate.Volume aggiunto < 1/10 la soluz. della Taq contiene glicerolo anticongelante

16. I passaggio:denaturazione iniziale, una sola volta per tutta la reazione da 3’ a 10’ a 94°-95°secondo la lunghezza del frammento. Ad ogni ciclo:denaturazione a 94°C 15’’- 45’’anche questa a seconda della lunghezza e dalla % GC/AT II passaggio:annealing dei primers secondo la TM tenendo la temp. 4°-10° al di sotto della TM si sceglie la temp. ottimale in modo sperimentale aggiustandola in modo da evitare amplificazione di frammenti aspecifici. La durata di questo passaggio puo’ variare da 15’’ad 1 minuto (puo’ dipendere anche dalla velocita’dello strumento a far variare la temperatura della piastra porta provette (velocita’ di rampa). III passaggio:sintesi del DNA a partire dai due primers (extension), la temp. e’ di solito 72°C. La durata puo’ essere di 15’’ fino ad 10 minuti se il frammento supera le 5 kb fino a 20kb. La temp. puo’ essere piu’ alta (max.75°C) o piu’ bassa. Se non ci sono frammenti aspecifici, si puo’ unificare con la fase di annealing e il ciclo sara’ di due fasi anche 64°- 68°C. Tempi di ogni passaggio (tipo di termociclatore)

17. Conclusioni: Ogni PCR va aggiustata empiricamente per: La quantita’ di DNA templato di partenza La conc. del MgCl standard a 1.5mM(tra 0.5 - 4.5mM) La conc. dei primers standard 15pmoli La conc. dei dNTPs da 50mM a 200mM per seq. molto lunghe o molto DNA da sintetizzare Il volume di reazione di solito varia tra 15 e 100  a seconda della quantita’ finale di DNA che vogliamo o dello strumento, per PCR preparative il volume puo’ essere maggiore (però piu’ lento a scaldarsi) I tempi delle varie fasi (passaggi) dei cicli dipendono anche dal tipo di macchina* che si usa, dal tipo di provette e dal volume di reaz. Se e’ moderna* e rapida nel passaggio da una temperatura ad un’altra delle tre temperature della reazione, si accorciano i tempi del ciclo.