BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG GEN S VIRUS VIÊM GAN B

1. VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁTMỘT SỐ ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG GEN S VIRUS VIÊM GAN B TS. Bạch Khánh Hoà Huế, 06-2006

2. Đặt vấn đề • Nhiễm virus viêm gan B: vấn đề mang tính toàn cầu • Việt Nam: vùng lưu hành dịch cao • Sự xuất hiện các đột biến trong hệ gen virus gây khó khăn cho việc chẩn đoán, dự phòng lây nhiễm & điều trị • Các đột biến vùng gen S gây biến đổi kháng nguyên bề mặt

3. Virus viêm gan B (HBV) • Thuộc họ Hepadnaviridae • Gây bệnh viêm gan B : • Cấp tính • Mạn tính (xơ gan, viêm gan, ung thư gan) • Con đường lây truyền: • Từ mẹ sang con • Tiêm chích • Tình dục

4. HBsAg Pre-S1 Pre-S2 ADN HBcAg Hình 1. Mô hình cấu trúc HBV

5. Hình 2. Cấu trúc hệ gen virus viêm gan B

6. Loop1 Loop2 142 145 137 139 147 124 Hình 3. Mô hình quyết định kháng nguyên “a” trên HBsAg Vị trí vùng quyết định kháng nguyên a: từ aa 110-160

7. Các kỹ thuật phát hiện virus viêm gan B • Thử nghiệm miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA) • Thử nghiệm miễn dịch gắn men (ELISA) • Phản ứng khuếch đại trình tự gen (PCR) • Phản ứng phát hiện axit nucleic (NAT)

8. Các dạng đột biến virus viêm gan B • Đột biến vùng gen S • Đột biến gen lõi (precore, core) • Đột biến gen polymerase • Đột biến gen X

9. Mục đích nghiên cứu • Tìm hiểu tần suất đột biến kháng nguyên bề mặt ở nhóm đối tượng mang HBsAg chưa qua điều trị. • Khảo sát một số dạng đột biến hay gặp ở vùng gen S virus viêm gan B.

10. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (1) • Đối tượng: • 75 bệnh nhân được chỉ định theo dõi viêm gan B (1 - 12/2005) tại Viện Huyết học - Truyền máu TW • Độ tuổi: 18-43

11. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (2) • Phương pháp nghiên cứu • Sàng lọc huyết thanh học • Kit ELISA Monolisa HBsAg Plus: phát hiện kháng nguyên bề mặt bình thường • Kit ELISA Monolisa HBsAg Ultra: phát hiện kháng nguyên bề mặt bình thường + các đột biến vùng gen S

12. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (3) • Khuếch đại gen bằng PCR • Tách chiết ADN từ máu toàn phần sử dụng bộ kit QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN, Mỹ) • Phản ứng PCR: Kit PCR Master mix (PROMEGA, Mỹ) • Cặp mồi sử dụng: theo nghiên cứu của Kobayashi & Koike (4) • Sản phẩm phản ứng được điện di trên agarose gel 1,5% và được phát hiện bằng tia UV.

13. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (4) • Giải trình tự nucleotide & axit amin tương ứng: • Sử dụng kit sinh phẩm và máy của hãng AppliedBioSystem (Mỹ). • Phần mềm xử lý số liệu: Sequencing analysis, SeqSpace, DNA Star.

14. Mẫu bệnh phẩm (huyết thanh) Sàng lọc Monolisa HBsAg Plus Sàng lọc Monolisa HBsAg Ultra Phát hiện ADN và khuyếch đại vùng gen S nhờ PCR Quy trình nghiên cứu

15. Điện di ADN trên gel agarose Tách ADN từ gel agarose Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của ADN Giải trình tự gen S Phân tích kết quả

16. Kết quả và bàn luận (1) • Sàng lọc huyết thanh học Trong tổng số 75 bệnh nhân được tiến hành xét nghiệm trên cả hai bộ kít, chúng tôi nhận thấy có 09 trường hợp (12%) có tỷ số OD mẫu/ngưỡng (S/CO) chênh lệch khá lớn. Những mẫu này nhiều khả năng chứa đột biến HBsAg, vì vậy chúng tôi lựa chọn để tiếp tục tiến hành phản ứng PCR.

17. Bảng 1. Danh sách mẫu có tỷ số S/CO chênh lệch lớn khi tiến hành xét nghiệm trên hai bộ kit

18. Kết quả và bàn luận (2) • Phản ứng PCR • Trong số 9 mẫu được tiến hành tách chiết ADN, khuếch đại bằng phản ứng PCR có 8 mẫu phát hiện được sản phẩm khuếch đại khi điện di trên gel agarose 1,5% • 01 mẫu không phát hiện thấy sản phẩm điện di

19. Hình 4. Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%

20. Kết quả và bàn luận (3) • Giải trình tự nucleotide và axit amin tương ứng • 08 mẫu hiện băng sản phẩm PCR được sử dụng tiếp cho việc giải trình tự nucleotide. Trình tự thu được sẽ được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng để xác định trình tự axit amin tương ứng. • Trình tự axit amin của 8 mẫu trên được so sánh với trình tự axit amin chuẩn (bình thường) AB031266 nhằm tìm ra những đột biến nếu có.

21. Hình 5. Phần mềm giải trình tự nucleotide vùng gen S virus viêm gan B

22. So sánh trình tự axit amin của 8 mẫu HBV với mẫu chuẩn AB031266

24. Bảng 2. Các đột biến phát hiện được sau khi giải trình tự

25. Kết quả và bàn luận (4) Tần số và phân bố ĐB điểm trên gen S: • Trong số 8 mẫu xác định được 41 ĐB (26 ĐB sai nghĩa + 15 ĐB im lặng) tại 27 vị trí, trung bình: 5 ĐB/mẫu. • Mỗi mẫu đều cóít nhất một đột biến sai nghĩa.

26. Kết quả và bàn luận (5) • Tần suất đột biến HBsAg ở nghiên cứu này là 10,7%, thấp hơn kết quả của TTT.Huy và cs (2003), LTT.Thuy & cs (2005), do: • Chưa giải trình tự nucleotide cho tất cả các mẫu • Đối tượng nghiên cứu không thuộc nhóm có áp lực miễn dịch cao

27. Kết quả và bàn luận (6) • Dạng đột biến: 100% là đột biến thay thế nucleotide dẫn đến thay thế axit amin tương ứng. • Vị trí đột biến: trong tổng số 26 đột biến có 4 đột biến xảy ra ở loop 1, không có đột biến nào ở loop 2, còn lại 22 đột biến nằm giữa vùng thuộc loop 1 – loop 2.

28. Kết luận 1- Tần suất đột biến vùng gen S ở bệnh nhân mang HBsAg dương tính chưa qua điều trị là 10.7%. 2- Dạng đột biến phổ biến nhất là đột biến thay thế nucleotide dẫn đến thay thế axit amin tương ứng.

29. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Huyết học - Truyền máu TW, Labo trung tâm Y sinh - Đại học Y Hà Nội, công ty BioRad và những cán bộ, bệnh nhân đã giúp đỡ chúng tôi tiến hành nghiên cứu này;- Xin cảm ơn sự theo dõi của quý vị đại biểu!