细胞生物学研究技术

1. 细胞生物学研究技术 福建农林大学生命科学学院 张 健

2. 一 细胞形态结构的观察方法 • （一）、光镜技术 • 1、几种常见光学显微镜 • A 普通光学显微镜 • 普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体；③机械装置，用于固定材料和观察方便。

4. ※分辨率与放大倍数 • 分辨率：指显微镜能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为： R=0.61λ /N．A． 其中N．A．＝ｎsinα/2 （n=介质折射率；α=镜口角；N.A.=镜口率； λ＝入射光波长） • 放大倍数＝物镜倍数 目镜倍数＝N.A（500－1000）

5. 部分介质的折射率 • 介质空气水香柏油α溴萘 • 折射率1 1.331.5151.66 • 普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm。

6. B 暗视野显微镜 • 使用特殊的照明方法，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 • 应用：观察未经染色的活体或胶体粒子。

8. C 相差显微镜（PCM） • 1953年获得诺贝尔物理奖，相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光（直射光和衍射光）的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 • 应用：观察未经染色的标本和活细胞。

10. 一种介壳虫的染色体（PCM照片）

11. D 倒置显微镜 • 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。

13. E 荧光显微镜 • 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

15. 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）

16. F 微分干涉差显微镜（DIC显微镜） • 能显示细胞结构的三维立体投影影像，立体感强，用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。

17. 尼康E800荧光DIC显微镜

18. DIC显微镜下的硅藻

19. G 激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜） • 可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得的一系列细胞不同平面上的图像叠加后，可重构出样品的三维结构。 • 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。

21. LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管

22. 2 光镜标本的制备 • 以石蜡切片为例： 材料处理 固定 脱水 包埋 切片 染色 观察 染色剂：普通染色剂，荧光染色剂

23. 3 光镜技术的应用 • A 观察活细胞的形态结构，生命运动， • 细胞周期。 • B 细胞器的定位及功能研究。 • C 基因产物与大分子物质的定位及定量。 • D 监测细胞代谢活动。

24. 例：胞内钙离子浓度的监测 • 钙是通用的第三信使，能特异地选择性地调节细胞的活动，因此测定细胞中钙离子浓度在空间和时间上的变化，对于监控许多细胞的生理活动有重要作用。如受精时，卵细胞突然定位地将钙离子释放到胞浆中。 • 钙指示剂：FuRA－2，水母发光蛋白等

25. 沙元双细胞胚中一个细胞的钙信号引起钙依赖水母发光蛋白发光沙元双细胞胚中一个细胞的钙信号引起钙依赖水母发光蛋白发光

26. 罗丹明123染色后显示的细胞线粒体的定位

27. （二）、电镜技术 • 1、透射电子显微镜（TEM） • 透射电子显微镜以电子束为光源，由于电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短，因而使其分辨力大大提高，目前TEM的分辨力可达0.2nm。 电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。

31. 2 扫描电子显微镜（SEM） • 扫描电子显微镜（SEM），可用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。

33. ※ SEM制片技术 • 固定 脱水及临界点干燥 装样 • 样品包被 观察 • 固定：组织培养细胞 戊二醛；大块组织 • 戊二醛＋四氧化铒（鸡尾酒固定法） • 包被：喷镀金属膜，使其在电子束的激发下，释放次级电子。

35. 3 扫描透射电子显微镜（STEM） • 是唯一不需要染色、固定而能够直接观测单个生物分子的仪器。世界上仅有几台。 • 4 扫描隧道显微镜（STM） • 获1986年诺贝尔物理学奖。 • 可用来显示晶体表面原子布阵。固态、液态和气态三态 物质均可进行观察，能直接观察生物大分子的原子布阵，也能观察一些生物结构的原子排列，有助于把生物学研究推进到纳米科学水平。

36. 5 冷冻断裂、冷冻蚀刻电镜技术 • 冰冻蚀刻亦称冰冻断裂。标本置于-100˚C的干冰或-196˚C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。

38. 二、生物化学与分子生物学技术 • （一）、细胞化学技术 • 组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemical staining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。

39. （二）、免疫细胞化学 • 免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。

40. （三）、显微光谱分析技术 • 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。

41. （四）、放射自显影术 • 放射自显影术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。

42. （五）、分子杂交技术 • 分子杂交技术（molecular hybridization）是在研究DNA分子复性变化基础上发展起来的一种技术。其原理是，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。

43. 三、细胞分离技术 • （一）、离心技术 • 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。

44. 1、差速离心 • 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器

45. 2、密度梯度离心 • 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。

46. （二）、流式细胞术 • 流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。

48. （三）、细胞电泳 • 在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳（cell electrophoresis）。引起细胞电泳的电位值称为ξ电位。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的ξ电位。ξ电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊断疾病上有一定价值。此外由于不同类型的细胞在电场中的泳动速度不同，细胞电泳尚可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开。

49. 四、细胞培养与细胞杂交 • 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外（in vitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cell culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。

50. 通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交（cell hybridization）。