第三章高效液相色谱法 (HPLC) 第一节概述

第三章高效液相色谱法 (HPLC) 第一节概述一．定义以液体为流动相的色谱法，包括 1．经典液相色谱法：普通固定相、流动相常压输送 2．高效液相色谱法：高压输送、高效固定相、在线检测、仪器化二．HPLC与GC应用范围对比 GC：有机物的20% HPLC：有机物的80% （适合挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物及离子型的化合物）

三．HPLC的特点： ①适用范围广 ②分离性能好 ③分析速度快 ④流动相可选择性范围宽 ⑤灵敏度高 ⑥色谱柱可反复使用 ⑦流出组分容易收集 ⑧安全

第二节高效液相色谱法分类与基本原理 一．HPLC的分类

二．基本原理 HPLC是将经典液相色谱法与气相色谱法的基本原理和实验方法相结合而产生的，因此气相色谱法的基本概念，保留值于分配系数的关系，塔板理论及速率理论，都可用于高效液相色谱法，他们的主要差别在于流动相的不同。（一）Van Deemter方程式 1．在GC中表现形式 H = A + B / u + C u --------填充柱 H = B / u + C u --毛细管柱（A = 0）

2．在HPLC中 B = 2γDm Dm∝ T / η HPLC中的Dm比GC中的Dg小105倍 H = A + C u u↑, H↑, n↓

第三节各类高效液相色谱法 一．液-固吸附色谱法（一）分离机制吸附色谱法是被分离的组分分子与流动相分子争夺吸附剂表面的活性中心，靠溶质分子的吸附系数的差别而分离。 k↑, tR↑, t’R↑

（二）固定相 1．硅胶多孔硅胶，表面积大，容量大。如（1）无定形多孔硅胶，塔板数2×104～5×104 m-1 （2）球形多孔硅胶，塔板数8×104 m-1 （3）堆积硅球，塔板数8×104 m-1 2．高分子多孔微球（有机胶）分离机制：吸附或吸附、分配及空间排斥兼有特点：柱效低（103m-1）, 但选择性好，峰形好

（三）流动相 烷烃（底剂）+ 极性调节剂----------二元、多元溶剂系统溶剂极性大，洗脱力强，k↓, tR↓ （四）固定相和流动相的选择 1．固定相的选择：5～10μm, 比表面积大，含水量小 2．流动相的选择：TLC（薄层色谱）为先导

二．液-液分配色谱法 （一）分离机制 1．正相液-液分配色谱法（NLLC）流动相极性小于固定相极性-------正相色谱正相洗脱, 极性小的先出色谱柱流动相极性↑，洗脱能力↑，k↓, tR↓

2．反相液-液分配色谱法（RLLC） 流动相极性大于固定相极性-------反相色谱流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑, tR↑ 极性大的先出色谱柱

三．化学键合相色谱法 (BPC) （一）反相键合相色谱法（RBPC）固定相：十八烷基键合相（ODS）流动相：MeOH – H2O, CH3CN - H2O 1.分离机制-------吸附、分配兼而有之 2.流动相极性与容量因子的关系流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑, tR↑ （主要用于非极性化合物的分离）

（二）正相键合相色谱法（NBPC） 固定相：氨基、氰基键合相氰基与硅胶相似，比硅胶极性小（硅胶可以分离的都可用氰基分离）氨基键合相------适合于分离糖类物质流动相：烷烃（底剂）+ 极性调节剂-----二元、多元溶剂系统 1．分离机制诱导力、色散力、范德华力 2．流动相极性与容量因子的关系流动相极性↑，洗脱能力↑，k↓, tR↓ 极性小的先出色谱柱

（三）离子对色谱法（PIC或IPC） RPIC----反相离子对色谱法（在极性流动相加入离子对试剂，被分析的样品离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不带电的中性离子对，增加样品离子在非极性固定相中的溶解度，分配系数增加，改善分离效果）， 1 离子对试剂：分离酸性或带负电荷物质，选择铵盐离子对分离碱性或带正电荷物质，选择烷基磺酸（硫酸）钠

2 分离机制离子对模式说 流动相pH值：pH2～8 有机溶剂的选择：甲醇、乙腈

（四）离子抑制色谱法 (ISC) 反相色谱法中，通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。 1．适用范围：3.0≤pKa≤7.0的弱酸，7.0≤pKa≤8.0的弱碱

2．容量因子及其影响因素 对于弱酸：pH＜pKa, 以分子形式存在，k↑, tR↑ pH＞pKa, 以离子形式存在，k↓, tR↓ 对于弱碱，情况相反 3.离子抑制色谱（反相）流动相中加入弱酸（HAc）或弱碱（NH3·H2O）或缓冲液（磷酸盐）流动相pH2～8

四．对流动相的要求和洗脱方式 （一）要求：（1）不与固定相发生化学反应（2）对样品有良好的溶解度 k 1～10 可用范围， k 2～5 最佳范围（3）与检测器相适应溶剂的截止波长，如水190nm, 甲醇205 nm，测定波长大于溶剂的截止波长（4）纯度高，粘度小

（二）洗脱方式： （1）恒组成溶剂洗脱（2）梯度洗脱（梯度淋洗或程序洗提）在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比。用于极性差别较大的混合物的分离。

薄层色谱法 一．分类和原理 1．定义：固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法称为薄层色谱法

2 分类

原理（吸附色谱法） • 吸附剂对物质A、B具有不同的吸 • 附能力，展开剂对A、B有不同的 • 溶解、解吸能力， • KA≠KB。K↑，移动速度慢。

二．薄层色谱 (TLC) 参数 （一）定性参数 1. 比移值（Rf）组分的Rf值主要受展开剂（柱色谱中的流动相）的组成、比例影响

定时展开： Rf = u / uo ①在TLC中定时展开，t相等 ②在柱色谱中定距展开，l = lo Rf可用范围为0.2～0.8, 最佳范围0.3～0.5

2. 相对比移值（Rr） Rf(a)，Rf(s)分别为组分a和参考物质s 在同一薄层板上、同一展开条件下测得的Rf值, la，ls分别为原点至组分 a和参考物质s的斑点中心的距离。优点：可消除系统误差，重现性好

（二）相平衡常数 1．分配系数与比移值之间的关系 R’ = u / uo , R’------组分在展开剂中出现的几率 Rf = l / lo = u / uo, 所以R’ = Rf Vs-------薄层板上固定相的体积，Vm------薄层板上展开剂的体积，组分K↑, Rf↓

被分离物质极性 吸附剂活度数（吸附能力）流动相极性小大小大小大 2．容量因子 (k) k = Ws / Wm = CsVs / CmVm = KVs / Vm Rf = 1 / (1+k) Ws------组分在固定相中的质量 Wm-----组分在展开剂中的质量 3．流动相（展开剂）及其选择

第三章高效液相色谱法 (HPLC) 第一节概述