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第三章 灭菌工程

第三章 灭菌工程. 提要：. 一、灭菌的基本原理 1 、几种常见的灭菌方法原理 2 、湿热灭菌的原理 二、培养基和发酵设备的灭菌 1 、培养基灭菌温度的选择 2 、培养基灭方法 3 、发酵设备的灭菌. 一、灭菌的基本原理. 1 、 灭菌 （ sterilization ） 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。灭菌可分杀菌和溶菌两种。 2 、灭菌目的 灭菌是发酵过程中维持纯培养状态，保证正常发酵的必要前提。 3 、灭菌对象 （ 1 ）环境的消毒灭菌 ：无菌室、生产车间等；

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第三章 灭菌工程

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Presentation Transcript

  1. 第三章 灭菌工程

  2. 提要： • 一、灭菌的基本原理 • 1、几种常见的灭菌方法原理 • 2、湿热灭菌的原理 • 二、培养基和发酵设备的灭菌 • 1、培养基灭菌温度的选择 • 2、培养基灭方法 • 3、发酵设备的灭菌

  3. 一、灭菌的基本原理 • 1、灭菌（sterilization） • 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。灭菌可分杀菌和溶菌两种。 • 2、灭菌目的 • 灭菌是发酵过程中维持纯培养状态，保证正常发酵的必要前提。 • 3、灭菌对象 • （1）环境的消毒灭菌：无菌室、生产车间等； • （2）设备的灭菌：种子罐、发酵罐、补料罐、管道、产品提纯设备等； • （3）材料的灭菌：培养基、补料、消泡剂等； • （4）操作人员的清洁消毒：

  4. （1）高温杀菌 • 3、灭菌方式

  5. 干热灭菌法：将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150～170℃下维持1～2 h后，即可达到彻底灭菌的目的。 • 在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。 • 灼烧：是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。 • 湿热灭菌法，多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子用80℃以上的温度处理才能杀死；而细菌的芽孢一般要在120℃下处理15min才能杀死。

  6. 巴氏消毒法（pasteurization）：目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法.巴氏消毒法（pasteurization）：目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法. • 低温维持法：在63℃下保持30分钟可进行牛奶消毒； • 高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在72℃下保持15秒钟。 • 间歇灭菌法：适用于不耐热培养基的灭菌。待灭菌的培养基在80～100℃下蒸煮15～60分钟，以杀死所有营养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。

  7. 常规加压灭菌法：盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽后将锅密闭，再继续加热至121℃（压力为1kg／cm2或15磅／英寸2），时间维持15～20分钟，也可采用在较低的温度（115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下维持35分钟的方法。常规加压灭菌法：盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽后将锅密闭，再继续加热至121℃（压力为1kg／cm2或15磅／英寸2），时间维持15～20分钟，也可采用在较低的温度（115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下维持35分钟的方法。 • 适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。 • 连续加压灭菌法：在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135～140℃下处理5～15秒钟。

  8. 高温对培养基成分的影响： • 消除高温有害影响的措施： • 采用特殊加热灭菌法； • 含易破坏成分的培养基应与其他成分分别灭菌后再合并，或者进行低压灭菌； • 对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先分别灭菌，再混合，避免产生磷酸盐沉淀。

  9. （2）控菌 • 消毒：就是消除传染源或致病菌，英文disinfection 也是“消除传染”的意思。消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。 防腐（antisepsis）：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。如：低温；缺氧；干燥；高渗 ；高酸度 ；防腐剂 化疗（chemotherapy）：利用具有高度选择毒力（对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖的一种措施。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。

  10. 二、 培养基的灭菌原理 • （一）培养基灭菌概述 • 1、培养基灭菌的定义 • 从培养基中杀灭或除去有生活能力的微生物营养体细胞及孢子的过程。 • 2、培养基灭菌的方式 • 主要是湿热灭菌法 • 3、湿热灭菌的基本原理 • 　　利用具有强大的穿透力的蒸汽冷凝时释放大量潜热，使微生物细胞中的原生质胶体和酶发生不可逆的凝固变性，从而在很短时间内死亡。

  11. 4、湿热灭菌的相关定义 • 致死温度：杀死微生物的极限温度。 • 致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。 • 微生物热阻：指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。 • 相对热阻：指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。

  12. 各种微生物对湿热的相对热阻

  13. 5、湿热灭菌的优点 • 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； • 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； • 蒸汽的潜热很大，能迅速释放大量热能； • 操作过程方便，控制管理容易。 • 6、培养基湿热灭菌需解决的工程问题 • 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数Nt（10-3），需要的温度和时间。 • 灭菌温度和时间的决定因素：杂菌、孢子的热灭死动力学；反应器的形式和操作方式；培养基中有效成分受热破坏的可接受范围。

  14. k AB 活细胞 死细胞 N0 Nt • （二）微生物的热灭死动力学方程 • 分子的分解和分子内部的重新排列的反应属于单分子反应。 • 杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热致死的主要原因是蛋白质变性，这种反应属与单分子反应，因此杂菌在一定温度下受热死亡遵循单分子反应方程。 • 即： • N：任一时刻的活细菌浓度（个/L） • t：时间（min） • K：比热死速率常数（min-1）

  15. K愈小则此菌愈耐热。Nt为0是不可能的，但在设计上常采用Nt=10-3，其工艺学意义：1000次灭菌中有一次失败的机会，或灭菌1000罐只残留1个活菌。K愈小则此菌愈耐热。Nt为0是不可能的，但在设计上常采用Nt=10-3，其工艺学意义：1000次灭菌中有一次失败的机会，或灭菌1000罐只残留1个活菌。 1、对数残留定律 • 杂菌致死为单一分子反应，则： • N：菌数（个）； t：灭菌时间（s)； K：反应速度常数（1/S）

  16. 2、培养基灭菌温度的选择 • 灭菌温度与反应常数关系（阿累尼乌斯公式）： • （A：比例常数；E：反应活化能； • R：气体常数；T：绝对温度） • 培养基成分受热破坏： • （各字母意义类同上式）

  17. lnK 1/T

  18. 灭菌时温度从T1 T2时：

  19. 杀灭细菌芽孢的活化能 E 大于维生素等营养物质破坏的活化能 E`(即E> E`)

  20. 说明: • 温度上升，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基成分破坏的速率常数倍数。 • 即：将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的E`很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少.因此，培养基灭菌宜采用“高温短时间”灭菌。

  21. 举例： lnK • ΔEBS=67000× 4.184（J/mol） • ΔEVB=22000× 4.184 （J/mol） • 将灭菌温度从105˚C提高到127 ˚C • KVB从0.02（min-1）提高到0.06（min -1） • KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min -1） 1/T 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和维生素B1的lnK-1/T图

  22. 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子灭死程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响嗜热脂肪芽孢杆菌孢子灭死程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响

  23. 3、灭菌时间计算 • 例：一罐40m3，121℃实灭，设每亳培养基中含耐热芽孢菌2 × 107个，此时的灭菌速度常数为0.0287s-1.求灭菌失败机率为0.001所需要的时间? • 解:N0=40 × 106 × 2 × 107 =8 ×1014(个) • Nt=0.001(个) • K=0.0287(s-1) • =2.303/0.0287log8×1017 =80.2 × 17.9 • = 1436 (s) = 23.9(min) • 答：灭菌失败机率为0.001所需要的灭菌时间23.9分钟。

  24. 三、灭菌的实际操作 • 1、空罐灭菌 • 也称空消。 • 种子罐、发酵罐、尿素（或液氨）罐、消泡罐，进行预先灭菌，为空罐灭菌。 • 空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。 • 操作条件：0.2-0.4MPa0.5—1h。

  25. T 维持温度 发酵温度 共同加热 夹套加热 保温阶段 冷却阶段 t • 2、实罐灭菌 • 将培养基置于发酵罐中用蒸汽夹套加热，达到80-90℃后再加蒸汽直接加热至预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度等到待接种发酵的过程，又称分批灭菌。 注意点：温度和压力的关系；泡沫问题；投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在罐壁上结垢的问题；菌结束后应立即引入无菌空气保压； 过程包括：升温、保温和冷却三阶段。 各阶段对灭菌的贡献率大约： 20%、75%、5%。

  26. 实罐灭菌中几种换热方式的温度-时间变化关系实罐灭菌中几种换热方式的温度-时间变化关系 • T：介质温度（K）；T0：介质初温（K）；t：时间（min）； • h：蒸汽相对于介质的热焓（kJ/kg）；s：蒸汽的重量流率（kg/min） • M：介质重量(kg)；Cp：介质比热[kJ/(kg.K)]； TH：热源温度(K) • U：总传热系数[kJ/（m2.min.K）]；q：传热速率（kJ/min） • C’p：冷却剂比热；W：冷却剂流率；TCO：冷却剂温度

  27. 3、培养基连续灭菌 • 1）喷淋冷却连消流程 • 2）真空冷却连消流程 • 3）板式换热器连消流程 • 优点：结构紧凑，传热效率高，应用范围广。 A.喷淋冷却连消流程

  28. B、真空冷却连消流程

  29. C、板式换热器连消流程

  30. 4、发酵设备的灭菌 • 种子罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌—— 0.15-0.18 MPa, 1h • 过滤器灭菌——0.1MPa, 0.5h • 接种管路——0.3-0.45MPa, 1h

  31. 5、影响灭菌的因素 • （1）灭菌效果与营养成分的保持； • （2）pH值（pH=6-8时，微生物最不易死亡；小于6时H+渗透性强，最易杀菌）； • （3）培养基成分（油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物耐热性）； • （4）培养基中微生物的数量及菌龄、耐热性； • （5）空气排除情况； • （6）起泡（泡沫会形成隔热层）； • （7）搅拌； • （8）颗粒（几微米颗粒灭菌只需几微秒，而对几毫米的颗粒，其所需时间约为0.632(TH-T0)(s)）

  32. 下一章：空气除菌

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