Přehled analytických metod II.

1. Přehled analytických metod II.

2. Metody • atomová spektrometrie (AAS, AES, kvantometry) • molekulová spektrometrie (UV/VIS, IČ, NMR) • chromatografie (GC, HPLC, TLC, CE) • hmotnostní spektrometrie • spojené techniky

3. Schéma spektrometrů emise absorpce fluorescence, rozptyl světla

4. Plamenová fotometrie plamen – monochromátor – fotoelektrický násobič – zpracování signálu • plamen – odpaření roztoku, atomizace a excitace atomů • (zářivou) deexcitací dochází k záření, jehož frekvence (vlnová délka) odpovídá rozdílu dvou energetických hladin elektronů • záření prochází monochromátorem a dopadá na fotonásobič • intenzita záření je závislá na množství analytu

5. Plamenová fotometrie • princip plamenové emisní spektroskopie s použitím plamene o nízké teplotě (propan, butan, jejich směsi nebo zemní plyn) • vlnové délky – Na+ - 589 nm, K+ - 767 nm, Ca2+ - 423 nm.. • kvantitativní analýza alkalických kovů a kovů alkalických zemin • vhodné pro stanovení v potravinách, nápojích, hnojivech, půdě, při těžbě kovů, v chemickém, farmaceutickém, papírenském a olejářském průmyslu

6. Atomová emisní spektrometrie • atomizace a excitace atomů – zářivá deexcitace • působení vysokých energií • čím složitější elektronový obal atomu, tím složitější spektrum (větší počet čar ve spektru) • čáry neionizovaných atomů, iontů • budící zdroj – záření (lasery), elektrická energie (oblouky, jiskry, výboje, plazmatron), chemické energie (plameny) • disperzní systém (mřížka, hranol) • detekce – fotonásobič (historie – fotografická deska) • kvantometry – rychlá multielementární analýza

7. FN plamen štěrbina výbojka s dutou katodou mřížkový monochromátor zavádění aerosolu vzorku dutá katoda – materiál ze stanovovaného kovu anoda – těžko tavitelný materiál (Zr, W..) Atomová absorpční spektrometrie

8. Atomová absorpční spektrometrie Monochromátor Fotonásobič mřížka dutá zrcadla uspořádání Czerny-Turner

9. Co s kolísáním signálu a neatomovou absorpcí ? VDK-výbojka s dutou katodou, DV-deuteriová výbojka, PZ-polopropustná zrcadla, DZ-dutá zrcadla, MOD-modulátor (rotující clona), PL-plamen (nebo grafitová kyveta), VZ-aerosol vzorku, MON-mřížkový monochromátor, FN-fotoelektrický násobič

10. AAS - shrnutí • atomizace (zmlženého) vzorku v plameni • emise záření s charakteristickými spektrálními čárami pro stanovovaný prvek – z duté katody • absorpce tohoto záření atomy analytu v plameni (nebo kyvetě) • zbytek záření (neabsorbované) prochází na fotonásobič • fotonásobič převede fotony na elektrony, zesílí signál a zaznamená proud

11. Molekulová spektrometrie • Ultrafialová a viditelná oblast (200 – 380 – 800 nm) • absorpcí záření určité vlnové délky dochází k excitaci valenčních elektronů • zdroj – deuteriová výbojka (UV), wolframová žárovka • disperzní systém (hranol, mřížka, filtr) • kyveta (křemenná – UV, skleněná, plastová), průtočná • detekce – fotonásobič • jednopaprskové • dvoupaprskové • diodové pole

12. Kalibrační graf - fenol 0.8 0.6 absorbance 0.4 y = 0.1542x - 0.0236 0.2 2 R = 0.9979 0 0 2 4 6 koncentrace (mg/l) Využití UV/VIS spektrometrie • kvalitativní analýza – poloha a intenzita pásů ve spektru (charakteristické pro chromoforní skupiny v molekule), atlasy spekter, malé rozdíly – často doplňkové informace k dalším metodám) • kvantitativní stanovení látek (kalibrace)

13. Infračervená spektrometrie (IČ, IR) • absorpce záření v oblasti (10 – 500 – 4000 – 10000) • absorpce je spojená se změnou vibračních a rotačních stavů molekuly • !! základní podmínka interakce IČ záření – musí docházet ke změně dipólového momentu během vibrace – HCl absorbuje, N2 neabsorbuje, CO2 ? • kvalitativní analýza – poloha a intenzita pásů ve spektru • ve spektru – valenční vibrace – vzdálenost jader - deformační vibrace – valenční úhly

14. IČ instrumentace • zdroj záření – tuhé zářiče z polovodičových materiálů (globar – SiC, Nernstova tyčinka oxidy zirkonia a yttria) • disperzní systém (několik mřížek, interferometr FT-IR) • kyvety – pro kapaliny a plyny (materiál KBr, NaCl) • pevné vzorky – tablety s KBr, nujolová suspenze (nasyc uhlovodíky –C20- C30), reflexní spektra • detekce - termoelektrický článek • zpracování signálu (odečet absorbance, v případě FT – matem. transformace, porovnání s databází)

15. C-halogen, mimorovinné deformační C-H valenční vibrace Y-H, násobné vazby oblast otisku prstu (C-C, C-N, C-O) IČ spektrum

16. Příklady IČ vibrací

17. IČ spektrum

18. Nukleární magnetická rezonance (NMR) • měřená látka je umístěna v silném magnetickém poli • musí být přítomna jádra s nenulovým jaderným magnetickým momentem se • absorpcí radiofrekvenčního záření dojde ke změně orientace magnetického momentu jádra – do vyšších energetických stavů (E1 E2) precesní pohyb Larmorova frekvence g-gyromag. poměr jádra do základní stavu přechází relaxačními procesy

19. NMR - instrumentace • magnet (supravodivý) – a - póly, b - přídavné cívky pro změnu B • vysokofrekvenční vysílač (elektromagnetické pole je orientováno kolmo na osu vnějšího pole magnetického) - c • sonda – kyveta se vzorkem - e • přijímač – indukční cívka - e • zpracování signálu (pulsní techniky – Fourierova transformace) e, f, g – registrační část k – kontrolní oscilokop

20. NMR – chemický posun • elektrony v okolí jádra ovlivňují velikost magnetické indukce v místě jádra  chemický posun d vM – frekvence měřeného pásu vST – rezonanční frekvence standardu (TMS)

21. A – důvod rozštěpení methylového píku - sousední methylenové protony B – důvod rozštěpení methylenového píku - sousední methylenové protony ¯­­ ­¯­ ­­¯ ¯¯­ ¯­¯ ­¯¯ ¯­ ­¯ ­­­ 1:3:3:1 ¯¯¯ ­­ 1:2:1 ¯¯ Spin – spinová interakce a integrální intenzita signálu integrální intenzita signálu: odpovídá počtu protonů

22. NMR - aplikace • 1H-NMR, 13C-NMR, 19F-NMR • strukturní analýza – spolu s MS nejsilnější nástroj vůbec !!! • kvantitativní analýza • studium rotace skupin v molekule, vodíkových vazeb

23. Separační techniky • klasické techniky – destilace, extrakce, filtrace, centrifugace .. Chromatografie • dělení podle mobilní fáze plyn – plynová chromatografie (GC) kapalina – kapalinová chromatografie (HPLC, TLC) Elektromigrační techniky • kapilární elektroforéza, isoelektrické fokusace ...

24. Chromatografie

25. Plynová chromatografie 1-tlaková láhev (nebo generátor plynu), 2-regulace tlaku, 3-regulace průtoku, 4-dávkovací zařízení, 5-detektor, 6-termostat, 7-kolona, 8-zesilovač, 9,10-počítač

26. kolona nosný plyn odpad Plynová chromatografie • nosný plyn – N2, H2, He, Ar • dávkování vzorku – vyhřívaná nástřiková hlava plynové vzorky (10-1000 ml) kapalné vzorky (1-100 ml) pevné vzorky (příprava roztoků) split/splitless:

27. Plynová chromatografie • kolony dnes prakticky výhradně kapilární kolony (průměr 0,1 – 0,5 mm, délka 10 – 100 m) • sorbenty – silikagel, aktivní uhlí, molekulová síta, porézní polymery • kapalné stacionární fáze – Carbowax (polyethylenglykol), polysiloxany, polyestery

28. Plynová chromatografie • detektory - tepelně vodivostní detektor plamenový ionizační detektor nedestruktivní, méně citlivý, univerzální destruktivní, citlivý selektivní - uhlovodíky

29. Plynová chromatografie • detektory - detektor elektronového záchytu nedestruktivní, citlivý, selektivní – halogenderiváty, nitrolátky - hmotnostní spektrometr – vysoce specifický, destruktivní, velmi citlivý

30. Plynová chromatografie • analýza těkavých látek • netěkavé látky – derivatizace, pyrolýza • vysoká účinnost • identifikace - retenční data • kvantifikace – plocha (výška) píku • výhodná kombinace s MS GC analýza PCB 1. 2-chlorbifenyl, 2. 4-chlorbifenyl, 3. 2,2'-dichlorbifenyl, 4. 2,4-dichlorbifenyl, 5. 4,4'-dichlorbifenyl, 6. 3,5,3'-trichlorbifenyl,7. 2,4,4'-trichlobifenyl, 8. 2,5,2',5'-tetrachlorbifenyl,9. 2,4,6,4'-tetrachlorbifenyl, 10. 3,4,4'-trichlorbifenyl,11. 2,3,4,6,2'-pentachlorbifenyl, 12. 2,3,4,4'-tetrachlorbifenyl,13. 2,3,4,5,2'-pentachlorbifenyl, 14. 2,4,5,2',4',5'-hexachlorbifenyl,15. 2,3,4,2',4',5'- hexachlorbifenyl, 16. 2,3,4,5,2',3'-hexachlorbifenyl

31. Kapalinová chromatografie 1,2 – zásobníky mobilní fáze 3 – programování gradientu 4 – směšovač 5 – odplyňovač 6 – vysokotlaké čerpadlo 7 – tlumič tlakových pulsů 8 – trojcestný ventil 9 – saturační předkolona 10 – dávkovací zařízení 11 – kolona 12 – detektor 13 – jímač frakcí 14 – zesilovač 15, 16 – vyhodnocování - počítač

32. Vysokotlaká čerpadla velkoobjemová stříkačka • Elektromotor s krokovým motorem • Převodovka • Závit na táhle pístu • Píst • Válec naplněný MF • Ke koloně • Ventil umožňující plnění čerpadla MF • Zásobník MF pístová čerpadla – malý objem činné části • Elektromotor • Převodový mechanismus • Píst • Pracovní prostor válce • Výtlačný ventil • Nasávací ventil • Ke koloně • Zásobník mobilní fáze • Těsnění pístu

33. Dávkovací ventily Schéma dávkování a) smyčka b) vnitřní dutina

34. A – pórovitý silikagel (>25mm) B – povrch film stac. fáze C –povrchová pórovitost D – mikropartikulární náplně (3 - 20mm) Kolony • Ovlivňování účinnosti • homogenní a rovnoměrné plnění kolony sorbentem • použití náplní s tenkou aktivní vrstvou na povrchu • zmenšování částeček sorbentu • monolity • Typy stacionární fáze • chemická modifikace silikagelu - sorbenty C-18, C-8 (reverzní fáze), C-2 • polymerní sorbenty (inertnost, menší mechanická stabilita) • iontoměniče • afinitní chromatografie

35. Detektory • Typy detektorů • Spektrofotometrický (UV-VIS) – absorpce záření • Refraktometrický - index lomu • Fluorescenční - fluorescence • Elektrochemický - potenciál, proud • Vodivostní - vodivost • Light scattering - rozptyl světla • Spojení s MS (MSn), IČ, NMR

36. 1–zdroj UV záření, 2-měrná cela, 3-referentní cela, 4 – fotočlánky, 5-optický systém detektoru, 6-přítok a odtok MF z kolony, 7-čistá MF Spektrofotometrický detektor

37. Detektor diodového pole

38. Fluorescenční detektor Schéma fluorimetrického detektoru • nutnost derivatizovat (nebo fluoreskující látky) • vyšší cena detektoru • vysoká citlivost 1-excitační zář.; 2-emisní fluorescenční zář.; 3-křemenná cela; 4-štěrbina; 5-maska s počerněným povrchem; 6-konkávní zrcadla 7-fotonásobič

39. Vodivostní detektor Principem je měření vodivosti během HPLC analýzy. Průchod vodivých analytů způsobí změnu vodivosti. • malý objem detekční cely (dvouelektrodové uspořádání) • často v bezkontaktním provedení • nejvíce využíván tam kde se analyzují ionty: • iontoměničová chromatografie • ion párová chromatografie • kapilární elektroforéza

40. Spojení s hmotnostní spektrometrií • Proč spojení HPLC/MS – co obě metody nabízí ? • HPLC je základní technika pro separaci netěkavých látek (od malých molekul léčiv až po proteiny) • hmotnostní spektrometr poskytuje informace pro identifikaci (molekulová hmotnost, struktura) při zachování ostatních vlastností detektoru (kvantifikace, sledování čistoty vzorku) • umožňuje analyzovat látky bez chromoforu • další rozměr selektivity separace (SIM, MS-MS pro izobarické látky)

41. tB 1.9 tA 1.4 signál 0.9 Dt=tB- tA 0.4 wB wA -0.1 0 5 10 15 20 čas Chromatogram Základní parametr chromatografie - Rozlišení • Analyticky významné parametry • identifikace – retenční časy • kvantifikace – plocha pod píkem • – výška píku

42. vi Ff Fe + - + Kapilární elektroforéza Fe ………….. elektrická síla Ff ………….. odporová síla Fe=zi.e.E Ff=k.h.vi pro kulové ionty k=6.p.ri Pro rovnost obou sil: zi.e.E = 6.p.h. ri .vi

43. Kapilární elektroforéza

44. EOF det Stěna kapiláry s disociovanými skupinami inj A1 + N - A2 K2 K1 difuzní vrstva Sternova vrstva (pevná) -SiOH Û –SiO- + H+ (pKa ~ 6) Elektroosmotický tok

45. 365 um 75 um Detekce • používají se kapiláry o velmi malém průměru(snadná disipace Jouleova ohřevu, kapilární síly převládají nad gravitací)

46. Detekce • UV/VIS – adaptované cely z kapalinové chromatografie • LIF – laserem indukovaná fluorescence • spojení s ESI-MS

47. Využití kapilární elektroforézy • vysoká účinnost • pružnost při optimalizaci selektivity • tolerance ke složitým matricím • rychlost (high throughput) • klinické a biochemické aplikace • farmacie ( problémy s QC) • životní prostředí • průmysl

48. Hmotnostní spektrometrie • ovlivňování pohybu iontů ve vakuu působením elektrického a magnetického pole • určení poměru hmotnosti ku náboji • měření intenzity iontů • hmotnostní spektrum • určení molekulové hmotnosti • přítomnost a poměr izotopů • přesné měření m/z – elementární složení iontu • fragmentace iontů – informace o struktuře látky • nejúčinnější identifikační nástroj v analytické chemii

49. m/z=94 Dm/z=28 Hmotnostní spektrometrie

50. Hmotnostní spektrometrie fragmenty molekulární pík izotop chloru