Cesta k DNA. Replikace, transkripce, translace.

1. 2008 Cesta k DNA. Replikace, transkripce, translace.

2. Cesta k DNA • 1869 němec Friedrich Miescher izoloval z buněčných jader látku, která byla bílá, slabě kyselá a obsahovala fosfor. Nazval ji proto nukleová (jaderná) kyselina. • 1920 P.A. Levene objevil, že nukleová kyselina může být rozložena na jednotlivé nukleotidy. Nukleotid obsahuje pětiuhlíkatý cukr, fosfátovou skupinu, a jednu ze čtyř bází: adenin, guanin, cytosin, tymin.

3. Cesta k DNA • Levene učinil dva závěry, jeden správný, jeden nesprávný: • každá dusíkatá báze se váže k molekule cukru, který se dále váže k fosfátové skupině (správně) • tyto nukleotidy jsou seskupeny po čtyřech v pravidelném pořádku v útvaru, který nazval tetranukleotid. Tento nesprávný názor se udržel přes deset let.

4. Cesta k DNA • 1928 Frederick Griffith hledal lék proti baktériím (Streptococcus pneumoniae), způsobujícím zápal plic: Griffith měl k dispozici dvě varianty baktérií: patogení (způsobující nemoc) a neškodnou

5. Cesta k DNA • Griffith byl překvapen, když v jedné variantě pokusu teplem usmrtil patogenní formu a injikoval ji do myší spolu s neškodnou formou: myši zemřely a v jejich krvi byly živé patogení bakterie. • Závěr: „něco“ z mrtvých patogeních bakterií muselo přejít do neškodných a přeměnit je v škodlivé. Griffith tuto látku nazval jednoduše transforming factor

6. Cesta k DNA„Averyho bomba“ • 1944 Oswald Avery, Maclyn McCarthy a Colin MacLeod po pečlivých analýzách zjistili, že Griffithův transforming factor je DNA Oswald Avery

7. Cesta k DNA Bakteriofág = virus, který se živí bakteriemi Na obrázku je bakterie Escherichia coli napadená fágy T4 Ve čtyřicátých letech začínají Max Delbrück a Salvador Luria experimenty s bakteriofágy. Fág T4

8. Další objevy • Alfred Mirsky objevil, že všechny buňky daného organismu obsahují stejné množství DNA. Výjimkou jsou gamety, pohlavní buňky, které obsahují pouze polovinu DNA

9. Chargaffova pravidla • Erwin Chargaff 1947 anylzoval DNA různých organismů a objevil, že • obsah jednotlivých dusíkatých bází se liší druh od druhu, ale v rámci buněk jednoho druhu je stálý • množství adeninu je stejné jako thyminu • množství guaninu je stejné jako cytosinu

10. Alfred Hershey a Marta Chase, 1952 • Bylo již známo, že fágy se sestávají z bílkovin a nukleových kyselin • rovněž bylo známo, že fágy dovedou nějak přeprogramovat bakterii v továrnu vyrábějící ve velkém množství kopie fágů

11. Alfred Hershey a Marta Chase, 1952 • V experimentu byla použita radioaktivní síra 35S a radioaktivní fosfor 32P. Fosfor se nachází v DNA ale ne v bílkovinách, síra se naopak nachází v bílkovinách, ale ne v DNA • bakterie vykazovaly radioaktivitu, pokud byly napadeny fágem obsahujícím radioaktivní fosfor. Pokud byly napadeny fágy s radiaktivní sírou, bakterie nevykazovaly radioaktivitu • Závěr: do bakterií vstupuje DNA a ne bílkoviny

12. Hershey-Chase experiment

13. Hledání trojrozměrné struktury • Začátkem 50.let již bylo známo složení řetězce DNA • předpokládalo se, že cukrfosfátová kostra je uprostřed a báze směřují ven všemi směry

14. Hledání trojrozměrné struktury Trojrozměrnou strukturu hledal Linus Pauling v USA (Kalifornie) a v Anglii Maurice Wilkins a Rosalinda Franklinová Linus Pauling, objevitel α-helixu u bílkovin

15. Rosalinda Franklinová Röentgen strukturní analýza neukazuje přímo tvar molekuly. Skvrny na obrázku jsou způsobeny tím, jak jsou röentgenové paprsky rozptýleny průchodem přes krystaly DNA. Matematicky lze z rozložní těchto skvrn odvodit trojrozměrnou strukturu molekuly

16. 1953 James Watson a Francis Crick objevili strukturu DNA„The Double Helix!“

17. Watson a Crick, duben 1953 • Užili výsledky röentgen srtukturní krystalografie Rosalindy Franklinové • odtud věděli šířku DNA: odhadli tak, že purin se musí párovat s pyrimidinem • užili drátěný model Článek v Nature měl jen jednu stránku a jeden řádek...

18. Erwin Chargaff: „Že za našich dnů mohou takoví trpaslíci vrhat tak dlouhé stíny, jen dokazuje, že se připozdívá…“

19. Struktura DNA

20. Vodíkové můstky drží dvoušroubovici pohromadě • Mezi thyminem a adeninem jsou dva vodíkové můstky • mezi guaninem a cytosinem jsou tři vodíkové můstky • toto párování je ve shodě s Chargaffovými pravidly

21. Model replikace DNA Molekula DNA má dva komplementární řetězce. A se páruje s T a C se páruje s G. Prvním krokem replikace je oddělení obou řetězců. Každý z řetězců nyní může sloužit jako matrice pro nový řetězec. Nové nukleotidy jsou potom spojeny cukr-fosfátovou kostrou. „Dceřinná“ molekula tak má jeden „rodičovský“ řetězec a jeden nový.

22. Replikace Poté co Watson a Crick navrhli dvoušroubovicový model DNA, byly navrženy tři modely pro replikaci: konzervativní, semikonzervativní a disperzivní. Semikonzervativní model se ukázal správný.

23. Matt Meselson a Franklin Stahl Matthew Meselson a Franklin Stahl potvrdili koncem 50.let semikonzervativní model replikace DNA V experimentu byl použit těžký izotop dusíku, 15N

24. Začátek replikace • Replikace začíná na místech DNA zvaných „origins of replication“ Bakteriální chromozom, který je kruhovitý má jedno místo ori, eukaryontní chromozomy mají počátků replikace mnoho. • Jádro somatické buňky člověka obsahuje 46 molekul DNA a více než 6 miliard pb (=párů bazí; angl. bp), jedno místo ori na chromosom by nestačilo. Zkopírovat toto obrovské množství pb trvá několik hodin (S-fáze) s přesností 1 chyba na cca miliardu pb.

25. Počátek replikace

26. Počátek replikace u prokaryot Baktérie: proteiny, schopné rozeznat sekvenci ori se k ní naváží a tím započnou replikační proces. Replikace potom postupuje oběma směry.

27. Počátek replikace u eukaryot • u eukarot je na každém chromosomu několik stovek až několik tisíc počátků replikace • podobně jako u prokaryot postupuje replikace na každé „bublině“ oběma směry

28. Elongace replikace • u prokaryot napojuje enzym DNA polymeráza 500 nukleotidů za vteřinu • u člověka je to jen 50 nukleotidů za vteřinu

29. Replikace Syntézu DNA katalyzuje enzym DNA polymeráza. Tento enzym používá jeden řetězec mateřské DNA jako templát. U bakterií je rychlost elongace asi 500 nukleotidů za vteřinu, u buněk člověka asi 50 nukleotidů za vteřinu

30. Energii pro replikaci dodávají trifosfáty ATP, GTP, CTP a TTP

31. Řetězce DNA jsouantiparalelní • Abychom odlišili číslování bází od číslování deoxyribózy, píšeme čísla uhlíků cukru s čárkou. • Každý řetězec DNA má tedy 3´konec a 5´ konec • řetězce DNA jsou antiparalelní, 5´konci jednoho řetěce odpovídá 3´konec druhého řetězce

32. Replikace Dva řetězce DNA jsou antiparalelní. DNA polymeráza ovšem může syntetizovat nový řetězec DNA pouze ve směru 5´ ke 3´. Nové nukleotidy jsou tedy přiřazovány pouze k 3´ konci. Tato vlastnost způsobuje problém pro replikaci dvouřetězcové DNA

33. Nový nukleotid se může připojit pouze ke 3´konci Nový řetězec DNA tedy může růst pouze ve směru 5´  3´

34. Replikační vidlička • Při replikaci DNA může DNA-polymeráza jednoduše přidávat k jednomu z řetězců nukleotidy ve směru 5´ 3´. Tomuto řetězci se říká vedoucí řetězec • Při elongaci druhého vlákna nové DNA se ale DNA-polymeráza musí pohybovat ve směru pryč od replikační vidličky. Řetězec takto syntetizované DNA se nazývá opožďující se řetězec Opožďující se řetězec Vedoucí řetězec

35. Opožďující se řetězec • Tak jak se replikační vidlička otevírá, jsou následně syntetizovány nové a nové části opožďujícího se řetězce. Opožďující se řetězec je tedy syntetizován jako serie segmentů • tyto segmenty se nazývají Okazakiho fragmenty a jsou u eukaryot dlouhé 100 -200 nukleotidů • enzym DNA-ligáza pak jednotlivé Okazakiho fragmenty spojuje do souvislého řetězce

36. Syntéza vedoucího a opožďujícího se řetězce DNA Vedoucí řetězec Opožďující se (váznoucí) řetězec

37. Primery • DNA-polymeráza má ještě jedno omezení: může přidávat nové nukleotidy pouze k již existujícímu řetězci. Při replikaci tedy musí být nějak zařízena syntéza několika prvních nukleotidů • Těchto několik prvních nukleotidů se nazývá primer a syntetizuje jej enzym primáza. Primer překvapivě není tvořen DNA, ale RNA • eukaryotické primery jsou 10-11 nukleotidů velké

38. Primery

39. Enzymy potřebné k replikaci • Helikáza - odvíjí dvoušroubovici DNA za vzniku dvou jednořetězcových vláken. Tato vlákna jsou chráněna SSB proteiny • Primáza - tvorba primerů • DNA-polymeráza • elongace nového řetězce • u opožďujícího se řetězce odstranění primeru a jeho nahrazení deoxyribonukleotidovou sekvencí • Ligáza - spojuje Okazakiho fragmenty • Gyráza – uvolňuje nadšroubovicové vinutí

40. Replikace Při syntéze DNA a při tvorbě replikační vidlice je třeba velkého množství enzymů a dalších proteinů. SSB proteiny chrání jednořetězcové úseky DNA (SSB = Single Strand Binding Proteins)

41. Ligáza SSB proteiny Primáza DNA polymeráza Helikáza

42. DNA replikace: enzymy (shrnutí)

43. Replikace DNA

44. Replikace DNAsoučasné představy

45. Replikace DNAsoučasné představy • Všechny enzymy potřebné k replikaci jsou zřejmě nějak spojeny a fungují jako jeden celek • tento enzymový komplex je zřejmě ukotven k nukleoskeletu a místo, aby se pohyboval po DNA, je spíše DNA komplexem protahována

46. Replikace DNA je velmi přesná

47. Oprava chybného párování bází(DNA mismatch repair) • Kdyby špatně nasyntetizovaný nukleotid nebyl odstraněn, došlo by v příštím kole replikace k zafixování chyby • Replikační aparát udělá cca 1 chybu na 107 nasyntetizovaných nukleotidů. • 99% z nich je pak odstraněno opravou chybného párování bází • jak opravný systém rozpozná který řetězec má opravit, není přesně známo

48. Oprava chybného párování bází(excizní reparace) • DNA je stále ohrožena, radioaktivním zářením, UV zářením, chemickými látkami atd. • každá buňka neustále monitoruje a opravuje svou DNA • u E. coli je známo asi 100 enzymů opravujících DNA, u člověka zatím asi 130 • 30% procent úmrtí v Evropě a USA jsou zapříčiněny rakovinou, která je způsobena selháním mechanismů opravy DNA

49. Oprava chybného párování bází(excizní reparace) • Na obr. je vidět vznik tzv. tyminových dimerů • toto poškození je iniciováno UV světlem • tyto dimery znesnadňují replikaci • pokud selžou opravné mechanismy, výsledkem může být choroba xeroderma pigmentosum

50. Xeroderma pigmentosum Lidem s touto dědičnou chorobou chybí enzym, provádějící excizní reparaci. Po osvitu sluncem je výsledkem rakovina kůže.