1 / 11

高铁 - 硫酸显色法测定血清总胆固醇

高铁 - 硫酸显色法测定血清总胆固醇.

trula
Télécharger la présentation

高铁 - 硫酸显色法测定血清总胆固醇

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 高铁-硫酸显色法测定血清总胆固醇

  2. 血清胆固醇(CHOL)测定方法种类繁多，化学方法大都用有机溶剂提取血清中的CHOL，用特殊试剂显色，然后比色测定。主要显色反应有Liebermann—Burchard(L-B)反应及高铁—硫酸反应等两类。这些方法须用腐蚀性的浓酸试剂，特异性差，干扰因素多，准确测定有赖于从血清中提取胆固醇，并对抽提液进行纯化。因此操作步骤多，不适于常规应用。美国疾病控制中心(CDC)脂类测定标准化实验室所审定的ALBK法，由于抽提液中基本上不存在L-B反应的干扰物，结果准确，为目前国际上通用的参考方法。此法虽然不很复杂，但也不易准确掌握。现在还有少数实验室应用L—B试剂直接显色法、邻苯二甲醛法等，准确性差，已在淘汰之列。

  3. Abell等于1952年推出血清皂化后石油醚(后改用正己烷)抽提，L-B反应显色法，其准确性可溯源于Schenheimer-Sperry法。国内曾有少数实验室用作常规分析，其实在一般实验室条件下，不易准确掌握。美国疾病控制与预防中心(CDC)对此法作了评价与最适化研究，已成为国际公认的参考方法，称之为ALBK法

  4. 【目的要求】 • 1.掌握血浆胆固醇总量的测定方法，包括脂溶性物质的定量提取，使用易燃有机溶剂的注意事项及胆固醇的显色。 • 2.熟悉测定原理及影响因素。 • 3.了解血浆胆固醇总量的正常范围及临床意义。

  5. 【实验原理】 用以丙醇沉淀血清蛋白质，提取上清液中的胆固醇，再用氧化铝吸附胆红素、磷脂、甘油等干扰物，离心后于上清液中加入高铁-硫酸试剂，反应产物显紫红色，其显色程度与TC成都成正比。

  6. 【操作】 1.提取纯化 分别吸取血清和标准液200ul，加至带塞的离心管中，在向离心管底部加入异丙醇5ml，是蛋白质沉淀，然后加入氧化铝1g，与振荡器上混合10min，2000r/min离心10min. 2.显色 分别取上清液1ml,分别加入到测定管和标准管，空白管加异丙醇1ml,56度水浴5min，再沿管壁加入显色剂3ml，充分混匀，水浴保温25min,冷却至室温比色。 3.比色 在540nm处，以空白管调零，读取各管吸光度。

  7. 【计算】血清TC= A测/A标*5.17mmol/L 血清参考值 3.0-5.2mmol/L 【注意事项】 1.抽提液与显色液混合时产生大量的热，影响显色反应。 （1）在测定同一批标本是选用型号一致的试管，口径大的试管便于快速混合。 （2）加入显色剂时，应使之与异丙醇分两层，然后迅速混合，是完全显色。 （3）显色剂要逐管加入快速混合，不可成批加入。 2. 反应中所用试管和比色杯应清洁干燥。 3. 防止浓硫酸吸水影响检测结果。

  8. 胆固醇酯与游离胆固醇在高铁反应显色程度一致，所以可以免去胆固醇酯水解反应，但不能省去抽提与吸附剂去除干扰物的过程。胆固醇酯与游离胆固醇在高铁反应显色程度一致，所以可以免去胆固醇酯水解反应，但不能省去抽提与吸附剂去除干扰物的过程。

  9. 四、分光光度计的光源检查和波长校正 • 【目的与要求】掌握分光光度计的光源检查和波长校正方法。【光源检查】光源检查即波长初步检查：不论何种分光光度计在校正之前都要先检查光源。检查方法是将波长选定在580nm处，将狭缝开到最大（或打开光门），打开钨灯，在比色皿内插一片白纸片。当光源正常时，应看到均匀的黄色光斑，边缘清晰整齐；如果明暗不匀，形状异常，则应调节光源灯的位置。调节方法是放松灯座固定螺丝，一边小心地向各个方向移动灯的位置，一边观察光斑变化，直至出现明亮均匀的黄色光斑为止。如系751型或高级分光光度计，这种调试工作还因灯泡固定机构复杂而应更细致，调好后要固定好。每次换新灯泡时都需要新调整。

  10. 【波长校正】分光光度计的波长精度随不同类型而异，且受温度影响，故常常需要对波长进行校正，即检查波长刻度与实际波长之差是否保持在一定的范围内，否则将使测定的误差增大。波长校正的方法很多，常用的有：①用含某些特定元素的玻璃来较正。最常用的有镨钕玻璃、钬玻璃等。校正时将这种玻璃放在比色皿座上，以空气调0，测定几个吸收峰值的波长是否相符即可。最常用的为573nm与586nm的双峰和741nm、808nm等处，如与刻度不符，需要时应调节准直镜角度进行校正。一般可见分光光度计波长精度只有 3～ 4nm，在此范围内一般可不调整。②可利用某些标准溶液进行校正，如标准重铬酸钾溶液(在1000ml 0.05mol/L的KOH中溶解0.0400g纯K2CrO4)，在25℃以1cm比色皿在各波长测定其标准吸光度，如表1-6。重铬酸钾溶液的优点是在紫外区270nm及370nm处有二个最大吸收。也可用硫酸钴铵[CoSO4(NH4)2SO4.6H2O]的0.0366mol/L溶液(每升中含14.46g)，此溶液在510nm有最大吸收，其标准吸光度值为0.174。

  11. 表1-6 标准K2CrO4 在不同波长的标准吸光度值波长 A 波长 A 波长 A 波长 A 波长 A220 0.4559 280 0.7235 340 0.3143 400 0.3872 460 0.0173230 0.1675 290 0.4295 350 0.5528 410 0.1972 470 0.0083240 0.2933 300 0.1518 360 0.8297 420 0.1261 480 0.0035250 0.4962 310 0.0458 370 0.9914 430 0.0841 490 0.0009260 0.6345 320 0.0620 380 0.9281 440 0.0535 500 0.0000270 0.7447 330 0.1457 390 0.6841 450 0.0325 • 【思考题】为什么要进行分光光度计的波长校正？如何进行分光光度计的波长校正？

More Related