Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením

1. Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením D.Vokurková1, J.Vávrová2, M.Řezáčová3, S.Filip4, J.Šinkora5 1 Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze 2 Katedra radiobiologie, Fakulta vojenského zdravotnictví UO, Hradec Králové 3 Ústav lékařské biochemie, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze 4 Klinika onkologie a radioterapie, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta UK, Hradec Králové 5 DakoCytomation AG,Brno

2. Cíl práce Prozkoumat mechanismy buněčné smrti u hematopoetických buněk za využití flow-cytometrických metod Zavést flow-cytometrické metody ke stanovení apoptózy u hematopoetických buněk, které by mohly být využity k diagnostice obdržené dávky u osob ozářených při radiačních nehodách

3. Zánik buňky po ozáření Poškození DNA úplný zlom dvojvlákna Jednoduché zlomy (SSB) potenciálně letální poškození DSB subletální poškození Reparace je možná mutace ! reparace Komplexní DSB Reparace velmi nesnadná APOPTÓZA Frakcionace dávky Ozáření s nízkým dávkovým příkonem

4. Buněčná smrt NEKRÓZA APOPTÓZA Zvětšení buněk Desorganizace Lýza (Programovaná buněčná smrt) Kondenzace cytoplazmy Zmenšení buněk Fragmentace DNA Apoptická tělíska Lymfocyty Hematopoetickékmenové buňky

5. Metody stanovení apoptózy • Morfologická detekce apoptózy na cytospinových preparátech barvených Giemza-Romanovski • Identifikace podle kondenzace a fragmentace jader a protruzí buněčného povrchu • Stanovení velikosti a granularity buněk (side a forward scater) • Analýza přítomnosti fosfatidylserinu (PS) na povrchu buněk • použitímAPOPTESTU TM-FITC (DAKO)pro dvojí značeníAnnexin V-FITC (vazba k PS) a propidium jodid (detekujícíjadernou DNA) • Stanovení mitochondriálního antigenu APO 2.7bez a s permeabilizací • Flow-cytometrická analýza buněčného cyklu a stanovení sub-diploidního obsahu DNA (sub-G1 buňky)

6. Indukce apoptózy • Lidská promyelocytární leukémie - HL-60 • Lidská T-lymfocytární leukémie - MOLT-4 • Hematopoetické kmenové buňky • Lymfocyty z periferní krve zdravých dárců • Lymfocyty z periferní krve pacientů s maligním onemocněním po ozařování

7. LIDSKÁ PROMYELOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE HL-60 D0 = 2, 2 Gy Rychlá interfázová smrt časná apoptóza Dávky nad 10 Gy Buňky umírají z fáze cyklu kde byly ozářeny Mitotická smrt oddálená apoptóza Zástava buněčného cyklu v S fázi a G2 fázi Reparace poškození Ozařování v G2 fázi zvyšuje radiorezistenci buněk Zkrácení bloku v G2 fázi - radiosenzibilizující efekt

8. HL-60 – 20 Gy - změny zastoupení buněk v buněčném cyklu a indukce apoptózy hodnocená podle subG1 vrcholu bez reparace Rychlý nástup interfázové apoptózy G1=44% S= 44% G2=12% A=2% A=12% A=87% A=48% G1=47% K 2 4 6 24 Čas po ozáření (h)

9. K 6 h 24 h 72 h 62% G1=42,2% S =45,4% G2=12,4% 85% 144 h HL-60 – 6 Gy - změny zastoupení buněk v buněčném cyklu a indukce apoptózy hodnocená podle subG1 vrcholu reparace poškozeníoddálená (postmitotická) apoptóza Oddálená apoptóza

10. NO 10Gy G 2=73% G1=42,2% S =45,4% G2=12,4% O 10Gy G 2=10% K 89 h 41 h 65 h 161 h Šetřící efekt ozařování s nízkým dávkovým příkonem na buňky HL-60 (reparace poškození v G2 bloku) Vliv ozáření s vysokým-0,6 Gy /1 minutu (O) a nízkým - 3,9 mGy /1minutu (NO) dávkovým příkonem na průběh buněčného cyklu a indukci apoptózy u buněk HL-60 ozářených dávkou 10 Gy. Čas představuje dobu od začátku ozařování .Skupina ozařovaná nízkým dávkovým příkonem byla ozařována 41 hodin. Z obrázku je patrno, že v konci dlouhodobého ozáření dávkou 10 Gy jsou všechny buňky v G2 fázi a reparují radiační poškození. Dávka není absolutně letální jako je to v případě jednorázového ozáření s vysokým dávkovým příkonem. 161 h po začátku ozařování jsou již přítomny prakticky všechny živé buňky

11. LIDSKÁ T- LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE MOLT-4 D0=0,8 Gy velká radiosenzitivita p53 wild typ relativně rychlá indukce apoptózy bez dlouhého bloku v G2 fázi

12. MOLT-4 – 3 Gy - Flow cytometrické stanovení obsahu DNA a buněčného cyklu 24 hodin po ozáření A= 3% G1= 29 % S= 49% G2= 19% K 6 h A= 1% G1= 57 % S= 37% G2= 5% 16 h 24 h A= 24 % G1= 11 % S= 53 % G2= 12 % A= 35% G1= 11 % S= 52% G2= 2% Apoptotickébuňky

13. Dávková závislost indukce apoptózy (detekované pomocí APO2.7) za 16 hodin po ozáření 16 hodin po ozáření buněk MOLT-4 vykazuje nárůst APO2.7 pozitivity lineárnídávkovou závislostv rozmezí dávek0.2-5 Gy.

14. Časová závislost indukce apoptózy po dávce 1 Gy K 1. 3. 6. 14. den FSxSS A/CD7 % A+ 11 36 47 24 12

15. Buňky MOLT-4 jsou citlivější k indukci apoptózy vyvolané ionizujícím zářením Malý blok v S a G2 fázi (malá reparace poškození) Význam proteinu p53 pro indukci apoptózy Buňky HL-60 jsou radiorezistentnější Bez p53 Dlouhý blok v G2 fázi, reparace poškození Ozařování s nízkým dávkovým příkonem má šetřící efekt, stoupá radiorezistence (D0), reparace poškození v G2 bloku probíhá již v průběhu ozařování Závěr – leukemické linie

16. 85% KMENOVÉ BUŇKY KRVETVORBY • vliv ionizujícího záření na kmenové buňky krvetvorby izolované z periferní krve zdravých dárců po mobilizaci G-CSF - izolovány na separátoru • PKB obsahovaly 0,5-1% CD133+ buněk, dále izolovány imunomagnetickou selekcí pomocí imunomagnetických partikulí izolující CD133 pozitivní buňky

17. Expanze CD133+ buněk (SCF, IL-3,FLT3-L) ex vivo • Buňky izolované imunomagnetickou separací jsou prakticky všechny v G0 fázi buněčného cyklu. Za 168 h po začátku expanze je 35% buněk v S fázi

18. S=35% Průběh buněčného cyklu a indukce apoptózy u buněk CD133+ ozářených in vitro 2,5 Gy a expandovaných ex vivo v přítomnosti cytokinů IL-3 + SCF + FLT3-L • 24h po ozáření je 60% buněk apoptických, maximum apoptózy bylo 72 h po ozáření (80%)

19. LIDSKÉ LYMFOCYTY Izolace z periferní krve In vitro ozáření Stanovení apoptózy (Annexin V) Změny počtu NK buněk

20. Buněčné změny v procesu apoptózy vedou ke ztrátě asymetrie membránových fosfolipidů během časné fáze apoptózy U živých buněk je phosphatidylserin (PS) na vnitřní straně buněčné membrány Během apoptózy je PS transportován na vnější stranu buněčné membrány a je přístupný pro vazbu annexinuV v přítomnosti Ca2+ iontů Metoda umožňuje současné stanovení povrchových znaků lymfocytů spolu s annexinem V Metoda stanovení anexinu V - indukce časné fáze apoptózy

21. Dynamika indukce apoptózy lidských lymfocytů (CD45+/CD14-) po in vitro ozáření dávkou 7 Gy Anexin V pozitivita A+ A+/PI+ Anexin Va propidium jodid pozitivita

22. Dávková závislost indukce apoptózy (detekované pomocí Annexinu V) za 16 hodin po ozáření ANNEXIN V – INDIKÁTOR DÁVKY ?

23. Dávkově závislá indukce apoptózy lymfocytárních subpopulací ozářených dávkou 5Gy

24. NK buňky • součást vrozené imunity • asi 15% ze všech cirkulujících lymfocytů • schopnost lyzovat cílové buňky • časný zdroj imunoregulačních cytokinů • podle density povrchového markeru CD56 – 2 odlišné populace • 90% - nízkodensitní exprese receptoru CD56 (CD56dim) a zároveň exprese vysokoafinitního (FcgRIII,CD16) – CD56dim/CD16 • hlavně cytotoxická aktivita • 10% NK – CD56bright/CD16dim, CD56briht/CD16- • produkceimunoregulačních cytokinů (IFNg) • nízká přirozená cytotoxicita

25. CD56dim CD56bright Subpopulace CD3-/CD8+/CD56dim CD3-/CD8+/CD56bright

26. INDUKCE APOPTÓZY U LYMFOCYTŮ PO OZÁŘENÍ IN VIVO • pacientka J. ozařována pro karcinom cervix uteri na lineárním urychlovači fotony s energií 6 MV • ozařovaná na oblast břicha frakcionovaně do celkové dávky 38 Gy (2 Gy/frakci) • původně plánovaná dávka 44 Gy • vzhledem ke zdravotním komplikacím pacientky redukována na 38 Gy • na obrázku znázorněno ozařovací pole

27. Změny počtu NK buněk v závislosti na čase u pacientky J. sloupečky představují vždy dávku záření 2 Gy

28. Vzestup počtu A+ NK buněk po frakcionovaném ozáření pacientky J. 1 hodinu po ozáření (tmavě fialová křivka) a po 24 h in vitro inkubaci v termostatu (světle fialová křivka) parciální ozáření 2 Gy vede k mírnému (nesignifikantnímu) vzestupu Annexin+ NK buněk především po 24 h inkubaci in vitro

29. Pokles relativního zastoupení NK buněk (CD3-/CD8+) a jejich subpopulací CD56dim a CD56bright po in vivo celotělovém ozářenípacientky dávkou 2 Gy. celotělová dávka 2 Gy vede k poklesu počtu NK buněk za 24 a především za 48 h po ozáření. Populace CD56brightse zdá být citlivější než populace CD56dim

30. Indukce apoptózy lymfocytů a NK buněk u pacientek s nádory endometria před a po ozáření malé oblasti břicha (box) 2 Gy Indukce apoptózy lymfocytů a NK buněk u pacientek s nádory endometria před a po ozáření malé oblasti břicha (box) 2 Gy. Dávka 2 Gy na relativné malou oblast břicha vede k vzestupu počtu apoptických NK buněk. U lymfocytů i T lymfocytů je vzestup po ozáření nevýrazný. Odpověd na ozáření je velmi nehomogenní.

31. Výrazný vzestup Srovnání % zastoupení A+ NK buněk u zdravých dárců a pacientů s nádory – před terapií Nejvyšší vzestup indukce apoptózy u NK buněk pacientůs nádory ve srovnání se zdravými dárci krve. Vzestup apoptózy u lymfocytů i T lymfocytů byl méně patrný.

32. Závěr • Dvoubarevná imunofenotypizace kombinovaná s analýzou navázaného Annexinu je dostatečná pro biodozimetrii v in vitro kultivovaných lymfocytech. • Studium NK buněk při ozáření in vivo pacientů s nádory je komplikováno faktem, že NK buňky reagují zvýšenou apoptózou na přítomnost nádorových buněk a procento apoptických buněk je již před ozářením významně vyšší než u zdravých dárců. • V případě ozáření pacientek s karcinomy endometria a čípku děložního technikou box (relativně malý objem oblasti břicha) došlo při 24 h inkubaci k relativně malému poklesu počtu NK buněk. • Po celotělovém ozáření pacientky s hematologickou malignitou (2 Gy) jsme prokázali výrazný pokles NK buněk především 48 h po ozáření, což je v souladu s experimenty in vitro. • Je tedy zřejmé, že doba inkubace po ozáření má zásadní význam pro průkaz poklesu NK buněk po malých dávkách záření. Práce vznikla za podpory grantu 202/04/0598 GAČR a MO ČR Záření II