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现代生物技术概论

现代生物技术概论. 赵奇. 生命科学系 校级精品课程. 学习目标： 重点掌握基因工程的概念和内涵； 认识基因工程研究的意义； 了解基因工程基本原理和操作过程，为进一步学习生物技术相关知识和从事基因工程工作打下基础； 对基因工程的发展动态有初步的了解. 第二章：基因工程. 第一节：概述. 一 、基因工程的诞生过程. （一）基因对生命的诠释 —— 生命的钥匙. 1 、从 “ 自然发生学说 ” 到达尔文的进化论. “ 自然发生说 ”. “ 进化论 ”. 2 、孟德尔的遗传规律. 基因分离和自由组合法则.

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Presentation Transcript

  1. 现代生物技术概论 赵奇 生命科学系 校级精品课程

  2. 学习目标： 重点掌握基因工程的概念和内涵； 认识基因工程研究的意义； 了解基因工程基本原理和操作过程，为进一步学习生物技术相关知识和从事基因工程工作打下基础； 对基因工程的发展动态有初步的了解 第二章：基因工程

  3. 第一节：概述 一 、基因工程的诞生过程 （一）基因对生命的诠释——生命的钥匙 1、从“自然发生学说”到达尔文的进化论 “自然发生说” “进化论”

  4. 2、孟德尔的遗传规律 基因分离和自由组合法则

  5. 摩根实验室用果蝇为材料的工作，确定基因在染色体上的分布规律。摩根实验室用果蝇为材料的工作，确定基因在染色体上的分布规律。 3、摩尔根的基因连锁和互换规律

  6. 4、基因的化学本质 Avery 证实遗传物质是 DNA 格里菲斯的肺炎双球菌转化实验

  7. 一切生物遗传的物质基础是DNA 生物界并非所有的基因都是由DNA构成的，某些动物病毒和植物病毒以及某些噬菌体等，它们的遗传物质则是RNA而不是DNA。

  8. 5 、DNA的双螺旋结构发现以后

  9. 遗传密码 三联体密码子:三个碱基编码一种氨基酸 三个终止密码子UAA，UAG，UGA 起始密码子:AUG

  10. 基因的调控机制:操纵子模型

  11. （二）基因工程的诞生 Cohen和Boyer的重组实验 预示着基因工程的诞生

  12. 含有特定遗传信息的核苷酸序列 基因 基因工程 基因工程是指一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿遗传并表达新的性状。

  13.  目的基因分离和改造  载体构建  目的基因插入载体  转移 扩增  基因表达产物的鉴定、收集、加工 二、基因工程操作的基本过程 上游工作 下游工作 产物的获取 （微生物、动物、植物）

  14. 三、基因工程研究的意义 1、促进工业技术革命 2、促进农业传统技术革新 3、促进医学技术的发展

  15. 第二节：工具酶与基因表达载体 基因工程工具酶—— 对DNA进行切割和拼接 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶

  16. 核酸酶:切割相邻的两个核苷酸残基之间的 磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷 酸链发生水解断裂的蛋白酶. 内切酶 核酸分子内部切割磷酸二酯键 作用 方式 外切酶 核酸分子的末端切割磷酸二酯键

  17. 2.内切酶的命名 三字母的命名原则： 即属名（首字母大写） + 种名（前两字母小写） + 株名 天然 PstI 限制性内切酶的来源是 【 】 Ａ Bacillus amyloliquefaciens Ｂ Escherichia coli Ｃ Haemophilus influenzae Ｄ Providencia stuartii

  18. 3.基因工程操作中常用的工具酶 （1）限制性内切酶和甲基化酶 限制(restriction)作用： 指细菌的限制性核酸酶对DNA的分解作用，一般是指对外源DNA侵入的限制。 修饰(modification)作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用(如甲基化)，经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。

  19. 限制性内切酶分为三类： Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型 Ⅱ型限制性内切酶特点 1.识别核苷酸序列，大多有回文结构 2. 具有特定的酶切位点 3.限制—修饰系统是由两种酶分子组成一种为限制性内切酶，另一种为独立的甲基化酶。

  20. 回文序列的特征

  21. DNA的两种切割方式：平切和交错切

  22. 2种不同类型的末端

  23. （2）DNA连接酶 DNA连接酶： 能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键把两段DNA连接起来的酶。

  24. 大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌连接酶 只能连接具有粘性末端的DNA片段

  25. 能连接黏性末端和平末端的DNA片段。

  26. （3）DNA聚合酶 DNA的体外合成反应 这些酶大多需要模板，合成产物的序列与模板互补

  27. 二、基因表达载体 基因克隆载体 承载外源DNA片段（基因）带入受体细胞 的传递者.

  28. ①能自我复制，并能带动插入的外源基因同步复制。①能自我复制，并能带动插入的外源基因同步复制。 ②具有限制性内切酶位点，最好是单一的酶切位点 ③具有合适的筛选标记 ④高拷贝 ⑤载体分子质量小，能容纳较大的外源DNA插入片段 ⑥在细胞内稳定性高 ⑦具有安全性

  29. 一、质粒载体

  30. 1、大肠杆菌质粒 生物特性： 高拷贝数 两种抗性选择 标记基因 多个单酶切位点

  31. 2.pUC18 ①分子量小(2.69kb), 能接受较大的外源片段 ②拷贝数多, 松弛型复制 ③装有多克隆（MSC）位点 ,克隆方便 ④LacZ ′的α-互补显色选择标记

  32. 3、农杆菌Ti质粒克隆载体 Ti质粒的遗传特性、结构及功能 ①T-DNA区域 转移DNA 有左边界（LB）和右边界（RB） 右边界是T-DNA转移不可缺少的

  33. ②Vir区（致病基因） 激活T-DNA的转移 ③复制起始点（Ori区） 调控Ti质粒的自我 复制 ④农杆碱分解代谢区 分解侵染产生的冠缨碱

  34. 第三节 基因工程基本技术 一、 目的基因的获取 目的基因 通过人工方法分离、改造、扩增能够表 达的特定基因，或者按计划获取的有经 济价值的基因

  35. 1.基因文库的构建与目的基因的分离 基因文库（gene library）： 一个生物体的全部遗传信息

  36. 构建步骤： 1.细胞基因组的提取与大片段DNA的切割； 2、载体的选择与制备 3、切割的DNA分子与载体连接、重组 4、体外包装及重组DNA分子的扩增 5、重组DNA分子的筛选与鉴定。

  37. 构建λ噬菌体 基因组文库

  38. 基因文库方法不是建立基因文库就获取了目的基因，而是通过建立了基因文库再利用探针在基因文库的大海中搜寻一定包含的目的基因。

  39. 2.基因芯片技术分离目的基因 （1）mRNA比较法 目的基因特异性表达进行分离

  40. （2）探针法： 利用同源探针从cDNA或EST微阵中筛选分离目的基因。 EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签—是从一个随机选择的cDNA 克隆，进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分

  41. 3.功能蛋白组分离目的基因 免疫筛选法

  42. 4.PCR技术在基因克隆中的应用 应用前提： 必须知道目的基因的全序列或者其两侧的序列 PCR的反应成分包括： ①一对寡核苷酸引物 ②具有热稳定性的酶 ③dNTP（四种脱氧核苷酸的混合物） ④作为模板的目的DNA序列

  43. PCR反应过程： 1、变性： 2、退火： 3、延伸：

  44. PCR分离目的基因的应用： （1）若已知目的基因序列, 设计引物，按照PCR体系进行，扩增出目的基因片段。 （2）通过mRNA差别显示（DDRT-PCR）鉴定和分离所需的目的基因。 (3)通过RT-PCR克隆到目的基因的cDNA区域进行cDNA文库的构建，通过锚定PCR或反向PCR可以快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因调控区等。

  45. 5.mRNA差别显示技术分离差别表达基因 课本流程图

  46. 6.插入突变法分离克隆目的基因 插入突变：当一段特定的DNA序列插入到植物基因的内部或临近位置时，一般会诱导该基因发生突变形成突变株，或插入位点形成一个新基因。

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