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ANTICUERPO PRIMARIO

INMUNOCITOQUÍMICA. CÉLULAS EN MONOCAPA. TRANSFECCIÓN. FIJACIÓN (paraformaldehído o gluteraldehido). fijación con metanol (fija y permeabiliza a la vez). PERMEABILIZACIÓN. BLOQUEO. ANALISIS POR MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA. LAVADOS. ANTICUERPO PRIMARIO. ANTICUERPO SECUNDARIO.

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ANTICUERPO PRIMARIO

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Presentation Transcript

  1. INMUNOCITOQUÍMICA CÉLULAS EN MONOCAPA TRANSFECCIÓN FIJACIÓN (paraformaldehído o gluteraldehido) fijación con metanol (fija y permeabiliza a la vez) PERMEABILIZACIÓN BLOQUEO ANALISIS POR MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA LAVADOS ANTICUERPO PRIMARIO ANTICUERPO SECUNDARIO

  2. Manipulación de células en cultivo: 1) MEDIO DE CULTIVO Composición Requerimientos Aporte *glucosa (fuente de C) *aminoácidos (fuente de N) *cofactores enzimáticos *vitaminas *sales Nutrientes MEDIO DE CULTIVO *Transferrina *Albumina, *Factores de crec. *Factores de anclaje Estimulo proliferativo y adhesivo SUERO *penicilina *estreptomicina *gentamicina ANTIBIOTICO Prevención de contaminaciones *hormonas *Factores de crec. SUPLEMENTO Estimulo especifico *Bicarbonato *Indicador: Rojo Fenol Mantiene el PH BUFFER

  3. 2) FACTORES FISICOQUIMICOS • PH: 7.2-7.5 • OSMOLARIDAD : 280-320mOsmol/kG • CO2: 2-5 % • TEMPERATURA: 35-37 ºC 3) ESTERILIDAD 1) Manipulación de células en flujo laminar 2) Exposición de luz UV dentro del gabinete del flujo por 15´ antes de empezar a trabajar 3) Todo el material usado debe estar estéril * por autoclavado (120 C, 1 atm, 20´) en el caso de tips, frascos, eppendorfs, pipetas, etc. * por filtración (poro de 0,2µM) en el caso de medio (antes del agregado de SFB y antibióticos), buffers, agua, etc. 4) Todo los elementos que ingresan al flujo laminar deben ser lavados con etanol 70%

  4. Tipos de transfección: 1) Coprecipitación por fosfato de calcio 2) Electroporación 3) DEAE-Dextran y Polibreno 4) Fusión de protoplastos 5) Lípidos cationicos (Liposomas) 6) Métodos Mecánicos *Microinjección *Biobalistica (gene gun)

  5. Gluteraldheído Paraformaldheido Metanol/Acetona Por puentes entre grupos aminos de las proteínas Por puentes entre grupos aminos de las proteínas Por precipitación de proteínas y carbohidratos Modo de acción Microscopia electrónica y algunos estudios de fluorescencia Ampliamente usado para estudios de fluorescencia e inmunocitoquímicos Gran variedad de estudios Uso mas frecuente *provee la mayor preservación de la estructura fina *es el mas severo delos fijadores *en gral. Altera los epitopes *provoca fluorescencia inespecifica *produce menor autofluorescencia que el gluteraldheído *menor cantidad de puentes que el gluteraldheído *penetra mas rápidamente dentro de la célula. *fijación mas rápida que el aldheído *frecuentemente altera el patrón de localización de antígenos *antígenos solubles pueden perderse *contracción de la muestra ventajas/ desventajas Fijación La función de la fijación es preservar la morfología celular y la localización y estructura de los antigenos lo mas fielmente posible a lo que ocurre en la realidad.

  6. PERMEABILIZACION Micela de detergente e agua

  7. Ruptura de la membrana por detergente.

  8. ANTICUERPOS • Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer y unirse específicamente y con alta afinidad a otras proteínas . • La molécula que induce la producción de anticuerpos se denomina antígeno. • Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopes.

  9. Policlonales Monoclonales Anticuerpos producidos por diferentes clones de linfocitos Anticuerpos producidos por un único clon de linfocitos Mezcla heterogénea de anticuerpos, reconocen distintos epitopes de un mismo antígeno. Población de anticuerpos homogéneos, reconoce un único epitope del anticuerpo Anticuerpos

  10. Anticuerpos policlonales Conejo, cabra, oveja, etc. Purificación de anticuerpos Separar elsuero

  11. Anticuerpos monoclonales • Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por fusión con células de mieloma de ratón. • Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el linfocito B normal parental y es inmortal como el mieloma que le dio origen.

  12. Anticuerpos monoclonales Células de mieloma Fusión Células productoras de anticuerpos hibridomas Producción de anticuerpos monoclonales

  13. Ventajascon respecto a los policlonales: Alta especificidad, reconocen un único epitope Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características. Desventajas: Mayor costo Anticuerpos monoclonales

  14. Inmunofluorescencia DIRECTA INDIRECTA primario secundario Anticuerpo marcado con fluoróforo • Mayor sensibilidad • El anticuerpo secundario puede ser usado para localizar cualquier anticuerpo primario producido en el mismo animal para el cual fue hecho el secundario Ventajas

  15. Inmunofluorescencia indirecta Células fijadas y permeabilizadas

  16. Inmunofluorescencia indirecta Células fijadas, permeabilizadas y bloqueadas

  17. Inmunofluorescencia indirecta • Anticuerpo primario (IgG) • anti-tubulina (producido en conejo) • anti-vinculina (producido en conejo)

  18. Inmunofluorescencia indirecta Anticuerpo secundario Anti-Conejo (producido en cabra)

  19. Inmunofluorescencia indirecta Microscopio de fluorescencia

  20. GFP-PTP 1B DAVINCILUNA

  21. ACTINA ACTINA/NUCLEO/RETICULO

  22. VINCULINA/NUCLEO/RETICULO

  23. MICROTUBULOS/NUCLEO/VESICULAS

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