16 DNA 复制

1. 16 DNA复制

2. 12.1 DNA复制是半保留式的 12.2 DNA复制是双向进行的 12.3 DNA聚合酶III催化复制叉处的聚合反应 12.4 DNA聚合酶III同时催化两条链的合成 12.5 复制叉移动需要多蛋白复合物 12.6 DNA复制起始于细菌染色体上的唯一的一个部位 12.7 DNA复制终止于ter区 12.8 DNA复制的其它方式 12.9 损伤的DNA可以修复

3. 遗传中心法则 DNA复制 RNA复制 转录 翻译 蛋白质 逆转录

4. 12.1 DNA复制方式是半保留式 Meselson- Stahl实验： 1、使E.coli在含有唯一氮源15N（15NH4Cl）的培养基中培养，合成的所有核苷酸都含有15N ，具有较高的密度，都整合到亲代DNA中。 2、将生长在15NH4Cl培养基的E.coli转移到含有唯一氮源，但密度较低的14N（14NH4Cl）培养基中培养。培养两代，并分别取每一代的DNA进行密度梯度离心。

5. E.coli 细胞 首先在15NH4Cl培养基中培养 然后转到14NH4Cl培养基中培养 只在15NH4Cl 中培养 只在14NH4Cl 中培养 提取DNA，进行密度梯度超离心 14N对照系统 15N对照系统 第一代 第二代

6. 实验结果表明DNA复制是半保留复制 用15N标记的亲本DNA 14N中第一次复制 14N中第二次复制

7. Meselson-stahl 实验 （a）密度梯度离心的DNA带 （b）对应于左侧DNA带的解释

8. 从前面图可以看出，在含有14N氮源介质中培养一代的DNA经密度梯度离心后，DNA带位于在15N培养基中的DNA带的上面。从前面图可以看出，在含有14N氮源介质中培养一代的DNA经密度梯度离心后，DNA带位于在15N培养基中的DNA带的上面。 在含有14N氮源介质中培养两代后的DNA经密度梯度离心后，出现两条带，第一条带位置与培养一带的DNA带相同，另一条DNA带位于第一条带上面，说明第二条带密度更轻。 实验结果充分说明DNA复制是半保留复制。

9. 12.2 DNA复制是双向进行的 两种复制模式 （a）单向复制模式 （b）双向复制模式

10. 复制起点 大肠杆菌染色体DNA双向复制模式 复制叉 复制叉

11. 真核生物DNA复制有多个复制起点，同时双向复制真核生物DNA复制有多个复制起点，同时双向复制

12. 12.3 DNA聚合酶III催化复制叉处的聚合反应 DNA合成时，核苷酸是通过酶催化加到一个正在延伸的DNA链上，这种酶要求一条完整的DNA链作为模板，去合成一条互补链，所以这样的酶叫做DNA指导的DNA聚合酶。 Arthur Kornberg（斯坦福大学医学院教授）等人从1955年开始寻找合成DNA的酶。于1956年在大肠杆菌的提取液中发现了DNA聚合酶。 Kornberg发现的DNA聚合酶就是现在的DNA聚合酶I，是分子量为109,000的一条多肽链，具有聚合活性及3ˊ-5ˊ外切酶活性，还有5ˊ-3ˊ核酸酶活性。以后又陆续发现了功能不同的另外几种DNA聚合酶，下表归纳了到目前为止从大肠杆菌和哺乳动物中发现的DNA聚合酶的基本特征。

13. PolIII的结构和功能，见P416 见P414；其中；Klenow片段：

14. 聚合反应的基本过程都是通过新合成的链的3ˊ-OH对进入的新的核苷三磷酸（用d NTP）的磷进行亲核攻击，导致磷酯键断裂，结果在链的3ˊ末端加上了一个新的核苷酸，即延长了一个核苷酸。 释放出的焦磷酸经焦磷酸酶水解有利于聚合反应的进行

15. 双重核对功能：①DNA聚合酶的选择作用； ②3’-5’外切酶的校对作用。 右图为“酶对底物的专一性的校正反应”。 [详见P414—415]

16. 12.4 DNA聚合酶III同时催化两条链的合成 由于DNA的两条模板链是反平行的，又因为DNA总是沿5ˊ→ 3ˊ方向合成，即两条新链是沿着相反方向合成。换句话说，就是一条子链的合成方向与复制叉移动的方向一致，该子链称为前导链；而另一条子链与复制叉移动的方向相反，这条链称之为滞后链，但也是通过通过5ˊ→ 3ˊ方向聚合形成的。 12.4.1 在滞后链中DNA的合成是不连续的 根据岗崎实验，可以确定复制叉的一个“杈”（前导链）是沿5ˊ-3ˊ方向连续合成的，而另一条链（滞后链）是通过岗崎片段方式不连续合成的。连续和不连续合成的结合使得复制叉整体向一个方向延伸。

17. DNA聚合酶III同时催化两条链的合成 先导链 复制叉移动方向 岗崎片段 滞后链

18. 前导链和滞后链的合成

19. 12.4.2 每个岗崎片段的合成开始于一个RNA引物 不连续合成解释了滞后链是怎样合成的，但不能解释每个岗崎片段是怎样开始合成的。DNA聚合酶III不能从头开始进行聚合反应，它只能将核苷酸加到已有的多核苷酸链上。所以为了合成滞后链，需要在复制叉处合成一系列的短的RNA引物。每个RNA引物都是与滞后链模板部分互补的，而且在DNA聚合酶III催化下从引物 3ˊ端延伸形成岗崎片段。 RNA引物是通过引发酶合成的，引发酶是一个称为引发体的大的复合物中的成分，引发体还包括使DNA解旋的解旋酶和其它的一些辅助蛋白。引发酶每秒钟催化一个大约长10个核苷酸的RNA引物的合成。由于复制叉移动的速度大约为每秒1000个核苷酸，所以大约每1000个核苷酸就要合成一个RNA引物。

20. 12.4.3 DNA pol I切去RNA引物，并使岗崎片段延伸 DNA pol I识别并结合于新DNA链的3ˊ端和下一个RNA引物之间的切口。然后5ˊ→ 3ˊ外切酶活性催化第1个RNA核苷酸水解，而5ˊ→ 3ˊ聚合酶活性将一个脱氧核苷酸加到新DNA链的3ˊ端，这种同时降解和合成的过程称为切口平移。 通过这种方式，使得切口沿滞后链移动。在完成切去RNA引物和填充RNA引物切去后的空缺后，DNA pol I 脱离DNA，留下了被一个切口（一个磷酸二酯键的空）分开的双链DNA。 最后在DNA连接酶催化下，一个岗崎片段的3ˊ末端和另一个岗崎片段的5ˊ磷酸基团之间形成一个磷酸二酯键，完成了两个岗崎片段的合成。

21. 解旋酶 引发体 单链结合蛋白 引物酶 DNA聚合酶III DNA聚合酶I DNA连接酶 前导链 滞后链

22. 12.5 复制叉移动需要多蛋白复合体 复制叉的移动除了需要用于聚合反应的DNA pol III以外，至少还需要四种其它蛋白质。其中主要的蛋白是解旋酶、拓扑异构酶、单链结合蛋白和DNA引发酶（也称为引物合成酶）。

23. 解旋酶：是个需要ATP的酶，该酶刚好在移动的复制叉的前面沿着单链DNA滑动。E.coli中最重要的解旋酶是DnaB，它是一个与引发体中的引发酶紧密聚合的蛋白质。DnaB使复制叉前面的双螺旋DNA解旋，解旋过程是与核苷三磷酸水解过程相偶联的。解旋酶：是个需要ATP的酶，该酶刚好在移动的复制叉的前面沿着单链DNA滑动。E.coli中最重要的解旋酶是DnaB，它是一个与引发体中的引发酶紧密聚合的蛋白质。DnaB使复制叉前面的双螺旋DNA解旋，解旋过程是与核苷三磷酸水解过程相偶联的。 拓扑异构酶I和II：是用来将解旋酶作用后产生的扭转张力释放掉。DNA快速解旋在复制叉处形成超螺旋头部。拓扑异构酶I是切断DNA中的一条链，使DNA旋转，而拓扑异构酶II可以切断DNA的两条链。

24. 单链结合蛋白（SSB）：其作用是当解旋酶作用后，它可以防止解开的螺旋恢复原来状态。它对单链DNA有非常高的亲和性，在滞后链合成的开始需要单链结合蛋白，螺旋解旋后，前导链可以连续合成时就不需要这种蛋白了。单链结合蛋白（SSB）：其作用是当解旋酶作用后，它可以防止解开的螺旋恢复原来状态。它对单链DNA有非常高的亲和性，在滞后链合成的开始需要单链结合蛋白，螺旋解旋后，前导链可以连续合成时就不需要这种蛋白了。 DNA引发酶：这个酶沿着滞后链在有规则的间隔内合成短的RNA引物。然后通过DNA pol III在引物的3ˊ-OH端沿着5ˊ-3ˊ方向合成岗崎片段。RNA引物可以被DNA pol I除去，然后用互补的脱氧核苷酸填上。在复制起点处前导链合成开始时也需要引发酶。

25. 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ OH P DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。 大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。

26. 连接酶的反应机制： 酶 + NAD+(ATP)酶-AMP + 烟酰胺单核苷酸（PPi） 酶-AMP + P-5‘-DNA 酶 + AMP-P-5’-DNA DNA-3’-OH + AMP-P-5’-DNA DNA-3’-O-P-5’-DNA+AMP • DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用

27. DNA复制示意图

28. 复制体(replicon) 在DNA复制过程中，由众多的酶和蛋白质参与DNA的复制作用。 复制体的基本活动包括： 1）双链的解开； 2）RNA引物的合成； 3）DNA链的延长； 4）切除RNA引物，填补缺口，连接DNA片段； 5）切除和修复错配碱基。

29. 12.6 细菌中的DNA复制起始于染色体上唯一的一个部位 E.coli中，是位于称为oriC遗传位点的单一一个起点。oriC区含有两种重复类型的多个拷贝，DnaA结合部位含有一个特殊的9碱基对重复序列（4个拷贝），另一部位是富含A-T13碱基对的重复区（3个拷贝）（图a）。 图b给出了在oriC处复制起始模式。大约有20个 DnaA蛋白与9碱基对重复区结合，并引起DNA结构的变化，导致富含13个A-T碱基对重复区内双螺旋变性。(见P422表34-4) 富含A-T重复区的部位起着使复制泡中心定位的作用。一旦这个区接近其它DNA复制蛋白，在解旋酶和SSB作用下复制泡沿双向延伸形成两个复制叉。然后引发酶合成RNA引物，而DNA pol III开始前导链和滞后链的合成。

30. E.coli 的oriC结构模式：a. OriC内富含A-T序列和4个9碱基对重复序列的分布；b.在oriC处复制起始模式

31. 12.7 DNA复制终止于ter区 在ter区内存在5个DNA序列（terA到terE）。ter序列排列在染色体上制造了一个复制叉“陷井”区，复制叉可以进入但不能出来。顺时针陷井由terB和terC构成，反时针陷井由terA、terD和terE构成。 陷井区是终止子利用物质（Tus）的结合部位。Tus可以和每一个ter结合。一旦形成Tus-ter复合物，就可以通过阻止解旋酶解旋DNA来封闭复制叉的通路。Tus-ter复合物只捕获来自一个方向（顺时针或反时针）的复制叉，而对来自另一个方向（反时针或顺时针）的复制叉不起作用。 终止区这样安排可确保两个从相反方向进入ter区的复制叉总能相遇，当一个复制叉遇到另一个复制叉时，DNA复制就完成了。

32. E.Coli中的ter区组织 600kb ter区含有5个非对称的ter部位，每个都可与Tus结合。 箭头表示为每个复制体设置的可能的终止部位

33. 12.8 真核生物DNA复制类似于原核生物DNA复制 • 真核生物染色体一般都比细菌染色体大得多，如E,coli基因组是由4.6×103kb组成的单一染色体，而真核生物通常含有一个以上的染色体，一般在20至30对染色体之间。虽然染色体数目的增加使得基因组更复杂，但所有生物中的DNA复制的生物化学机制基本上是类似的。 • 真核生物DNA复制还有以下一些特点: • 真核生物所含的DNA聚合酶种类更多些。 • 真核生物复制叉处需要的辅助蛋白不同。 • 真核生物也象E.coli那样，复制是双向的。但E.coli染色体含有唯一的复制起点，而真核生物染色体存在许多复制起点。

34. 真核生物中DNA的复制特点 1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。 2、冈崎片段长约200bp. 3、真核生物DNA复制速度比原核慢。 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。 5、真核生物有多种DNA聚合酶。 6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。

35. 12.9 DNA复制的其它方式 滚环复制 首先一个引发体组装在模板链（＋链）上 ，开始合成RNA引物，然后在DNA pol III作用下，引物延伸生成一个互补链（－链）。 生成的双链DNA分子通过一个噬菌体编码的内切酶在＋链上的特定部位制造一个缺口。 最后在DNA pol III作用下，＋链从暴露出的3ˊ羟基延伸，取代原来的＋链。

37. D-环复制 线粒体DNA的复制采取的是一种特殊的D-环复制方式： 环状双螺旋DNA在某一点解旋，开始复制。但前导链和滞后链的起点不在同一位点。 首先合成前导链，结果一条链（滞后链模板）仍维持单链。形成一个D字型的环。当前导链合成到某一点时，露出滞后链的起点，滞后链开始复制。

38. 12.10 利用RNA作为模板，逆转录酶可以催化DNA合成 逆转录病毒的基因组是RNA分子，在感染期间，RNA分子可以逆转录为DNA分子。DNA再转录生产病毒RNA，或者与宿主DNA分子整合，使病毒潜伏于宿主后代中。 将逆转录病毒RNA转换成DNA的最关键酶是逆转录酶。该酶具有RNase H活性（降解RNA活性）和DNA聚合酶活性。

39. mRNA RNA-DNA杂化体 单链DNA 双链DNA mRNA的cDNA拷贝

40. 逆转录病毒生活循环中的7个主要过程

41. ① 逆转录病毒进入宿主细胞； ② 在逆转录酶的催化下，以病毒的RNA为模板合成互 补DNA（cDNA），形成RNA-DNA杂化体，逆转录酶 将杂化体中的RNA降解，同时以剩下的DNA链为模 板合成另一条互补的DNA链，结果形成双链DNA； ③ 双链DNA整合到宿主DNA中； ④ 利用宿主复制和转录机器生产大量的病毒RNA； ⑤ 转录出的mRNA翻译成病毒的包膜蛋白，逆转录酶 和壳体蛋白；

42. ⑥ 将病毒RNA、逆转录酶和壳体蛋白组装成病毒 的核壳体； ⑦ 核壳体结合包膜蛋白形成完整的逆转录病毒。 逆转录酶没有3ˊ 5ˊ外切酶活性或校正活性，所以它的错误率比任何DNA聚合酶都高，例如人免疫缺陷病毒I（HIV I）逆转录酶每合成2000到4000核苷酸就会掺入一个不正确的碱基，这也部分说明了HIV I的高突变率。

43. 12.11 损伤的DNA可以修复 1、脱嘌呤、脱氨和形成胸腺嘧啶二聚体都可能造成DNA损伤 DNA损伤常见形式是通过N-糖苷键的水解，鸟嘌呤或腺嘌呤的自发脱嘌呤作用形成脱氧核糖。据估计人体内细胞中每天每109碱基对就有多达103碱基对发生脱嘌呤。另一种类型损伤是胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，如果不能校正，在DNA复制后，一个C-G碱基对就将变成一个A-T碱基对了。

44. 化学因素：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。化学因素：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。

45. U C 胞嘧啶脱氨如不校正将导致： G-C突变为A-T U A

46. 紫外线和离子辐射诱导有可能形成胸腺嘧啶二聚体。一个胸腺嘧啶的C-5、C-6与相邻胸腺嘧啶上同样位置的碳之间形成一个环丁基环，结果使得DNA骨架的结构发生了改变，有可能引起与互补链上的相应的腺嘌呤残基之间的氢键断裂。紫外线和离子辐射诱导有可能形成胸腺嘧啶二聚体。一个胸腺嘧啶的C-5、C-6与相邻胸腺嘧啶上同样位置的碳之间形成一个环丁基环，结果使得DNA骨架的结构发生了改变，有可能引起与互补链上的相应的腺嘌呤残基之间的氢键断裂。 胸腺嘧啶形成的示意图

47. 2 在E.coli中存在5种基本的修复系统 E.coli中存在的5种基本类型的DNA修复系统：直接修复， (核苷酸与碱基)切除修复、错配修复、重组修复和SOS修复。 A.直接修复 某些损伤的核苷酸和错配的碱基可以被某些蛋白质识别和修复。他们不切断DNA或切除碱基而是直接实施修复，这样的损伤修复机制称为直接修复。 DNA损伤之一的胸腺嘧啶二聚体可以通过直接修复机制修复。胸腺嘧啶二聚体是紫外线辐射造成的，光激活酶可以结合胸腺嘧啶二聚体引起的扭曲了的双螺旋部位。在可见光存在下，光激活酶催化两个胸腺嘧啶碱基再生，正常的A-T碱基对重新形成，然后光复活酶从已修复好的DNA上脱落。

48. 通过光复活酶修复胸腺嘧啶二聚体的过程

49. B. 核苷酸切除修复 修复酶是由基因uvrA、uvrB和uvrC分别编码的三个亚基组成的，所以该酶又称为ABC切除核酸酶。 首先ABC切除核酸酶从损伤部位的两侧切去含有损伤的DNA链，结果都出现一个单链缺口。然后在DNA聚合酶催化下按照互补链填充缺口，切口最后通过DNA连接酶连接。

50. C. 碱基切除修复 DNA糖基化酶是一个能识别DNA中象尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤那样的不正确碱基的酶，这些碱基都是由胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤分别脱氨形成的。这样变型的碱基可以通过DNA糖基化酶切断N-糖苷键除去，这样一来在DNA中制造了脱嘌呤或脱嘧啶的部位，通常将这样的部位称之AP位点。 每种DNA糖基化酶通常对一种类型的碱基损伤特异。例如尿嘧啶糖基化酶就可以除去由于胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶，形成一个AP位点。然后一个称为AP内切核酸酶切去含有AP位点的脱氧核糖-5-磷酸，出现一个核苷酸空隙。然后在DNA聚合酶作用下重新放置一个正确的核苷酸，最后通过DNA连接酶将切口封闭。