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重组 DNA 技术

重组 DNA 技术. Recombinant DNA Technology. 主讲：李志红. 后续内容. 重组 DNA 技术（基因克隆） 基因的体外表达与蛋白质的纯化、基因的生物学功能鉴定 癌基因与抑癌基因 基因诊断与基因治疗 考试. 成绩评定. 平时成绩 网上作业（ 3 次）、平时点名 占 40% 课程考试成绩 占 60%. Gene Cloning. What does the term cloning mean?

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重组 DNA 技术

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Presentation Transcript

  1. 重组DNA技术 Recombinant DNA Technology 主讲：李志红

  2. 后续内容 • 重组DNA技术（基因克隆） • 基因的体外表达与蛋白质的纯化、基因的生物学功能鉴定 • 癌基因与抑癌基因 • 基因诊断与基因治疗 • 考试

  3. 成绩评定 • 平时成绩 • 网上作业（3次）、平时点名 • 占40% • 课程考试成绩 • 占60%

  4. Gene Cloning • What does the term cloning mean? • What is gene cloning? How does it differ from cloning an entire organism? • Why is gene cloning done? • How is gene cloning accomplished ?

  5. 照亮细胞的荧光蛋白 转基因植物

  6. 脑神经网络 （Brainbow）

  7. 绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP ) • 在宣布获奖名单时，瑞典皇家科学院诺贝尔化学奖评审委员会主席贡纳尔·冯·海涅手持一支试管，内装用绿色荧光蛋白基因改造过的大肠杆菌。用紫外线照射后，试管发出绿色荧光。冯·海涅说，这种级别的发现“能让科学家的心跳比平时快上三倍”。 • 美联社援引哈佛大学医学和放射医学副教授约翰·弗兰焦尼的话评价说：“这一技术彻底改变了医学研究。研究人员第一次能在活体细胞和活生生的动物身上同时研究基因与蛋白。”

  8. Cloning - a definition • From the Greek - klon, a twig • Clone: a collection of molecules or cells, all identical to an original molecule or cell. • Also named asexual multiplication.

  9. 重组DNA 技术 (Recombinant DNA technology) 指应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。

  10. 1.分 基因克隆总体技术路线图 2.切 3.接 4.转 5.筛

  11. 第一节 载体（vector） Definition: allowing theexogenous DNA to be inserted, stored, and manipulated mainly at DNA level. 一、载体的分类 • 按功能分：克隆型载体、表达型载体 • 按受体细胞分： • 原核细胞载体 • 真核细胞载体 • 穿梭载体 • 按载体来源分：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体、粘粒载体

  12. 多克隆位点 polylinker Amp 复制起始点 ori 遗传标记 载体的选择标准 • 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。

  13. 质粒载体pBR322 • 复制起始点 (ori) • 选择标记 (ampr tetr) • 单一的酶切位点 • “P”表示是一种质粒； • “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; • “322”表示实验编号。

  14. 二、不同载体的特点和分类 （一）质粒载体 质粒(plasmid)－是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。 质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。

  15. 作为载体的质粒一般具有以下特点 • 分子相对较小（3～10 kb）； • 松驰型复制； • 具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入； • 具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子； • 质粒能携带的外源DNA片段一般较小（<15kb）； • 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。

  16. MCS－multiple cloning site • 在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

  17. 几种常用的抗生素抗性基因

  18. （二）噬菌体载体 • 线性双链DNA分子 • 插入型载体/替代型载体 • 用于构建基因组文库和cDNA文库

  19. Bacteriophage vectors • Advantages: • Useful for cloning large DNA fragments (10 - 23 kb) • Inherent size selection for large inserts • Disadvantages: • Less easy to handle

  20. λ phage 溶源阶段 (整合到寄主染色体上) 溶菌阶段 (复制和释放)

  21. 48.5 kb in length • Linear or circular genome (cos ends)

  22. DNA Protein coat λ phage Long (left) arm short (right) arm cos cos Nonessential region 12bp Exogenous DNA (~20-23 kb)

  23. λ重组体DNA分子的体外包装 • 体外包装：把重组DNA分子包装成成熟的噬菌体颗粒 • 包装限制：λ噬菌体的包装能力，控制在野生型λDNA长度(48kb)的75%-105% • 包装上限51kb ，必要基因28kb，故克隆上限为23kb.

  24. （四）人工染色体 • 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时柯斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 • 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。 • 当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人工染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 • 酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes, YAC） • 细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes, BAC） 容量大！！！

  25. BACs and YACs • Advantages: • Useful for cloning extremely large DNA fragments (100 - 2,000 kb) • This is very important for genome sequencing projects • Disadvantages: • Not easy to handle extremely large DNA molecules

  26. 细菌人工染色体 (BAC) • 细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间。 • 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。 • pBACs主要适用于： • 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 • 构建动植物基因文库

  27. BAC载体 CmR: 氯霉素抗性基因 • 装载量范围: • 50 - 300 kb parA、parB: 控制拷贝数 repE: 控制F质粒复制

  28. 酵母人工染色体（YAC) 酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)和来自四膜虫的端粒(Tel)等功能性DNA序列组成。它可携带长达200-1000kb的DNA片段，因此在人基因组DNA大片段的克隆中非常有用，是染色体克隆排序的主要工具。 用酵母人工染色体克隆DNA的过程与λ噬菌体相似，将DNA大片段与载体的两臂相联，然后将连接混合物转化进酵母细胞中，利用载体上的选择性标记进行筛选。

  29. YAC载体 可携带长达200-1000kb的DNA片段 正常酵母人工染色体含有： * 四膜虫端粒（tel) * 酵母自主复制序列（ARS) * 酵母着丝点 (CEN) * 酵母的选择标记 (TRP1、URA3)

  30. （五）病毒载体 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。 感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体 DNA病毒载体,RNA病毒载体 常用病毒载体:猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等 目的：外源蛋白表达或试验其功能, 基因治疗等。

  31. 逆转录病毒载体

  32. What determines the choice of vector? • insert size • vector size • restriction sites • copy number • cloning efficiency • ability to screen for inserts • what down-stream experiments do you plan?

  33. 第二节 基因过程中常用的工具酶

  34. （一）限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE) 限制性核酸内切酶--能识别并切割特定的核苷酸序列（回文序列） • 粘性末端 • 平末端 • 核酸内切酶的发现 • Daniel Nathans, Werner Arber, and Hamilton Smith. • Nobel Prize in Medicine in 1978

  35. 分类 • Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ • （基因工程技术中常用Ⅱ型） • 作用 • 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。

  36. 属 种 株 序 命名 Hin dⅢ Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 前三个字母用斜体

  37. GGATCC CCTAGG GTCGAC CAGCTG G CCTAG GATCC G GTC CAG GAC CTG Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口 HindⅡ Bam HⅠ + + 平端切口(blunt end) 粘端切口(sticky end)

  38. G CCTAG G CCTAG GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG GATCC G GATCC G • 同功异源酶 • 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 Bam HⅠ + BstⅠ +

  39. AGATCT TCTAGA GGATCC CCTAGG GATCC G A TCTAG GATCT A G CCTAG • 同尾酶 • 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。 Bg lⅡ Bam HⅠ + +

  40. （二）DNA连接酶 T4 DNA连接酶 连接反应最适温度12～20℃ 平末端连接温度可适当提高！

  41. T4 DNA ligase

  42. （三）DNA聚合酶 • 大肠杆菌DNA聚合酶 I • Klenow聚合酶 －补平、标记探针、合成cDNA 、测序！！ 3 5  外切活性、聚合活性 • Taq DNA聚合酶－PCR • 反转录酶－RT-PCR 聚合活性、RNaseH 活性

  43. （四）其它修饰酶 碱性磷酸酶－切除5端的磷酸基，防止自身环化 末端脱氧核苷酸转移酶－寡核苷酸探针的末端标记

  44. 第三节 目的基因的获得 目的基因（外源基因） cDNA /基因组DNA • 直接从染色体DNA中分离 • 化学合成 • PCR或RT-PCR体外扩增目的基因 • 从基因组文库中筛选 • 向目的基因所有者或其所在的实验室索取

  45. * 化学合成法获取目的基因 • 化学合成法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备，采用DNA自动合成仪进行. 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列

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