国家自然科学基金 标书写作分析

1. 国家自然科学基金 标书写作分析 miR-19b致胚胎心脏畸形的机制研究

2. 思路与背景介绍

3. miR-19b致胚胎心脏畸形的机制研究 • 心脏发育很重要 • 从胎儿畸形心脏-正常心脏中寻找研究线索----差异miRNA • miRNA19b差异明显、生物信息学分析发现其在物种间功能保守 • 做实验发现： miRNA19b过表达可以导致斑马鱼心脏畸形（功能） • 读心脏发育文献：影响WNT、BMP、TGFbeta是怀疑的可能机制（机制） • 生物信息学分析发现： miRNA19b下游靶标是WNT1 • 临床标本确定：WNT是变化的、与miRNA19b关系是一致的 • 提出问题：究竟是不是这个机制？（主线与研究内容）

4. miR-19b致胚胎心脏畸形的机制研究 确定有无创新 • 源头创新： miR-19b与先心关系未见报道 • 切入点： miR-19b（主要论述点） 确定科学问题 • 一个科学问题： miR-19b致胚胎心脏畸形的机制？ • 一条主线： Wnt机制（经典通路、研究的内容） 提取关键词 • 三个关键词： miR-19b 、先心、Wnt （miR-19b、心脏畸形、机制）

5. miR-19b Wnt 先心 ？ 具体分析（画图） • miR-19b与先心关系：因果关系吗？ 临床先心标本： 发现miR-19b差异表达 斑马鱼实验： miR-19b过表达出现心脏畸形 缺乏： miR-19b沉默与表型之间的关系 • Wnt与先心关系：OK • miR-19b与Wnt关系：怎样想到的？有证据吗？ 临床先心标本 miR-19b与Wnt表达变化的方向 斑马鱼标本 miR-19b过表达时Wnt通路变化 缺乏： miR-19b沉默时Wnt通路变化 miR-19b一定通过Wnt通路作用吗？ miR-19b与Wnt有直接结合位点吗？

6. 确定研究内容 一条主线下的三个层次 （一）整体验证（miR-19b与心脏畸形）及相关性评价（Wnt）： miR-19b表达异常对斑马鱼胚胎心脏发育及Wnt信号通路的影响 （二）机制分析：miRNA-19b影响Wnt信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制 1. miR-19b与Wnt1过表达对斑马鱼心脏畸形的影响 2. miR-19b与Wnt1沉默表达对斑马鱼心脏畸形的影响 （三）机制验证：miR-19b对Wnt1的调控机制

7. 写作策略 • 故事讲述：1）先心防治现状与危害 研究的必要性、意义 2）目前有关遗传学研究进展 国内外进展，提出miRNA 3）有关miRNA与先心 找到更新的会有价值 4）miR-19b的发现与先心关系无，创新性 5）在斑马鱼的研究结果整体功能指标 6）信息分析其可能机制WNT通路引出 7）临床标本+斑马鱼看WNT通路论证其机制的可能性 8）课题拟研究思路 展现全貌 9）研究成功将带来的价值 研究价值

8. 标书初步写作 摘要与立项依据部分

9. (限400字)：miRNAs 在胚胎心脏发育中发挥着重要的作用。前期应用下一代测序和miRNA芯片筛选均发现心脏畸形流产胎儿心脏组织中miR-19b 表达异常，miR-19b 过表达可致斑马鱼心脏发育畸形；生物信息学分析发现Wnt1 为miR-19b 的靶基因，在心脏畸形流产胎儿心脏组织中Wnt1 蛋白表达下调, Wnt 信号通路下游蛋白GSK3β表达上调，提示miR-19b 可能通过影响Wnt 信号通路致胚胎心脏畸形。本研究拟在体观察miRNA-19b 致斑马鱼胚胎心脏畸形；应用基因沉默和过表达，论证miRNA-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建miR-19b 表达载体和含野生型或突变体的Wnt1 启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入P19 细胞，揭示miR-19b 对Wnt1 的调控机制。研究具有源头创新性，并可能阐明miR-19b 致胚胎心脏畸形的机制，为先天性心脏病在胚胎期的早期防治提供帮助。

10. 立项依据 脊椎动物的心脏是胚胎发育过程中最早形成并行驶功能的器官，其发生需经由多细胞系特化、管状结构形成、最后精确组装成成熟4个心腔结构等发育过程，需要一系列重要的形态发生事件，包括细胞决定、细胞迁移和细胞分化等[1]，其间有多条信号通路（如Wnt 信号通路、Notch 信号通路等）参与其发育调控[2,3]，以保证胚胎心脏形成在时间和空间的协调发育。由于心脏的血液循环功能对脊椎动物的生存起关键作用，心脏发育畸形不但严重影响动物生后的宫外生活质量，而且常导致流产、死胎等[4]，因此有关胚胎心脏畸形的研究近年来受到普遍重视，并已成为预防医学领域疾病早期防治的一个热点研究内容。

11. 现已知，miRNAs 参与调控胚胎心脏的发育，在心肌细胞的生长及分化过程中发挥着极其重要的作用[5]。已有研究报道靶向敲除特异的miRNA 与心脏畸形密切相关，其中敲除小鼠的miRNA-1-2 导致50%小鼠发生室间隔缺损而死亡, 存活小鼠解剖发现心室穿孔[6]；敲除miRNA-133a-1/miRNA-133a-2 的小鼠胚胎发生心脏心室壁变薄和心室发育缺陷[7]；在敲除斑马鱼胚胎miRNA-138 的研究中，发现斑马鱼心房和心室发育异常，心肌前体细胞成熟受阻[8]。虽然上述与心脏畸形相关miRNAs 的研究已经取得了一些进展，但目前明确对胚胎具有心脏致畸作用的miRNAs 并不多，因而采用下一代测序或生物芯片等技术筛选与胚胎期心脏畸形相关的差异miRNAs，对其表达调控机制进行研究显得尤为重要[9]。

12. 近年来，采用下一代测序或生物芯片等技术主要用于筛选模式动物（斑马鱼、小鼠）胚胎期心脏畸形相关的差异miRNAs，未见文献对心脏畸形流产胎儿心脏组织相关的差异miRNAs 的筛选研究报道[5]。本研究小组利用我院产前超声诊断科对孕中期胎儿进行系统超声检查的优势，收集到超声筛查并确诊的胎儿左心发育不良孕妇（孕21w）3 例，家属从优生优育的角度要求流产；同时收集到未婚先孕来我院要求流产的同胎龄3 例正常胎儿的孕妇作为对照（见工作基础中图1），征得医院伦理委员会和孕妇家属的同意，对流产胎儿进行尸检并留取胎儿的心脏组织进行实验研究。我们在南方医科大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金（miRNA 在胎儿先天性心脏病中的差异表达研究，项目号：NFYKDX2010012，2010.1～2011.12，在研）的资助下，同时应用下一代

13. 测序和生物芯片技术对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织的miRNA 表达谱进行分析，结果均发现8 个miRNA 在左心发育不良流产胎儿心脏组织与正常对照之间存在3 倍以上的差异表达，并和real-time PCR 验证的结果一致（见工作基础中图2~6）。其中miRNA-19b 在进化上高度保守（见工作基础中表1）；在斑马鱼、犬、人的胚胎心脏发育早期及生后均有表达[11,12]；已有研究应用miRNA 芯片筛选成人扩张性心肌病人心脏组织发现miRNA-19b 表达异常的报道[10]；结合我们发现miRNA-19b 在孕中期左心发育不良胎儿心脏组织中表达明显上调，提示miRNA-19b在心脏发育早期起到重要的作用。我们采用体外合成miRNA-19b 前体显微注射入斑马鱼受精卵，结果发现受精后72 h 斑马鱼心脏扩大，心肌管未能环化，提示胚胎期miRNA-19b 过表达可致胚胎心脏畸形（见工作基础中图7）。鉴于miRNA-19b 致胚胎心脏畸形及其机制目前未见报道，因此有必要开展在体实验研究，并深入探讨其机制。

14. 现已知，心脏起源于中胚层，其胚胎时期的发生发育主要受Wnt 信号通路[2]、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路[13]、Notch 信号通路[3]等调控。其中，虽然BMP 信号通路与Notch 信号通路在胚胎心脏早期发生过程中起关键作用，但均需通过Wnt 信号通路来完成心肌细胞的特化，提示Wnt 信号通路在胚胎心脏发育中的重要作用。经典的Wnt 信号通路参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡等过程[2]，配体Wnt1 蛋白是其激动分子，当配体蛋白与细胞表面卷曲蛋白（Frizzled）家族的七次跨膜受体结合后，能够通过激活胞质中Dsh（dishevelled）蛋白，抑制GSK3β（glycogen synthase kinase 3β）的磷酸激酶活性，拮抗β-连环蛋白（β-catenin）的降解，使其在胞质中大量聚集，并进入细胞核结合TCF/LEF 家族的转录因子，从而激活下游不同靶基因如cyclin D 等，呈现其生物学效应[2]。因此，经典的Wnt 信号通路中，Wnt1 是该信号通路的启动因子，GSK3β是其功能的调节开关，而β-catenin 则是其功能的执行者。

15. 我们通过生物信息学对miRNA-19b 的靶基因进行预测[14]，发现Wnt 信号通路中关键蛋白Wnt1 为其潜在靶基因，两者的互补结合序列在进化上高度保守（见工作基础中图8）；本研究小组前期对孕鼠子代心脏发育异常的实验研究中，发现孕鼠子代心脏畸形与Wnt 信号通路密切相关[15]，因而我们联想到是否Wnt 信号通路也在miRNA-19b 致胚胎心脏畸形中起到重要的作用。我们进一步对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织中Wnt 信号通路中关键分子（Wnt1、GSK3β、β-catenin）的蛋白和基因水平进行研究，发现β-catenin 表达下调， GSK3β 表达上调，两者mRNA 和蛋白水平的变化幅度一致；而Wnt1 mRNA 表达不变，蛋白表达水平下调（见工作基础中图9），提示Wnt 信号通路在miRNA-19b 致胚胎心脏畸形中起作用，Wnt1 可能和miRNA-19b 直接结合，抑制Wnt1 的翻译，但不影响其转录，这和miRNA 通过碱基配对方式结合靶基因mRNA 的3′UTR，导致靶基因的翻译受抑制，但不影响其转录的特点是一致的[16]，但这并不能作为miRNA-19b 与Wnt1 直接作用的证据，为了确认Wnt1 是miRNA-19b 的直接靶位点，可以采用荧光素酶报告基因实验进行鉴定[17]。前期通过生物信息学预测发现Wnt1 启动子的一段碱基序列“UUUGCAC”和miRNA-19b上的保守序列“AAACGUG”互补结合（见工作基础中图8），这可用于进行荧光素酶报告基因实验揭示miRNA-19b 是否通过这个互补位点直接结合靶基因Wnt1，进而调控Wnt 信号通路。

16. 鉴于上述分析和我们已获得的研究结论，本研究拟以早期心脏发生中发挥重要作用的Wnt 信号通路为切入点，深入探讨miRNA-19b 致胚胎心脏发育畸形的机制。首先通过分析miRNA-19b 过表达或表达沉默时斑马鱼心脏发育情况（如心脏发育异常个体的百分比、心率）及对Wnt 信号通路的影响（原位杂交观察斑马鱼心肌中Wnt信号通路中相关基因Wnt1、GSK3β、β-catenin 的表达水平），获得miRNA-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形较充分的实验证据；继而分别构建Wnt1 与miRNA-19b 的过表达或沉默表达载体，通过双载体转染（“miRNA-19b 沉默+ Wnt1 过表达”或“miRNA-19b 过表达+Wnt1 沉默”） 观察斑马鱼心脏发育情况，论证miRNA-19b影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建miRNA-19b 表达载体和含野生型或突变体的Wnt1 启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入中胚层来源的P19 细胞，通过检测荧光素酶的活性及Wnt 信号通路中关键分子Wnt1、GSK3β、β-catenin 的基因和蛋白表达水平的变化，揭示miRNA-19b 对Wnt1 的调控机制。由于miRNA-19b 致胚胎心脏畸形及其机制研究目前未见报道，本研究具有源头创新性。研究若成功，将为阐明miRNA-19b 致胚胎心脏畸形的机制提供新的线索，为先天性心脏病在妊娠期的早期防治提供新的理论依据。

17. 写作点评 miR-19b致胚胎心脏畸形的机制研究

19. (限400字)：miRNAs 在胚胎心脏发育中发挥着重要的作用。前期应用下一代测序和miRNA芯片筛选均发现心脏畸形流产胎儿心脏组织中miR-19b 表达异常，miR-19b 过表达可致斑马鱼心脏发育畸形；生物信息学分析发现Wnt1 为miR-19b 的靶基因，在心脏畸形流产胎儿心脏组织中Wnt1 蛋白表达下调, Wnt 信号通路下游蛋白GSK3β表达上调，提示miR-19b 可能通过影响Wnt 信号通路致胚胎心脏畸形。本研究拟在体观察miRNA-19b 致斑马鱼胚胎心脏畸形；应用基因沉默和过表达，论证miRNA-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建miR-19b 表达载体和含野生型或突变体的Wnt1 启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入P19 细胞，揭示miR-19b 对Wnt1 的调控机制。研究具有源头创新性，并可能阐明miR-19b 致胚胎心脏畸形的机制，为先天性心脏病在胚胎期的早期防治提供帮助。

20. miR-19b是我们应用下一代测序技术、结合miRNA芯片，筛选发现的一条在左心发育不良流产胚胎心肌组织中表达显著上调的miRNA。前期发现：miR-19b过表达可致斑马鱼出现心脏畸形表型；生物信息学预测Wnt1是miR-19b的靶基因，我们则发现畸形胚胎心肌组织中Wnt信号通路也明显受抑（Wnt1表达下调、GSK3β表达上调），提示miR-19b致胚胎心脏发育畸形的机制与Wnt信号通路有关。本研究拟：在体观察miR-19b过表达、表达沉默与斑马鱼胚胎心脏畸形、Wnt信号通路变化间的关系；以Wnt信号通路为切入点，结合吗啡啉修饰的反义寡核苷酸技术和过表达技术，评判miR-19b致胚胎心脏发育畸形的机制；采用荧光素酶报告基因技术，揭示miR-19b对Wnt1的分子调控机制。miR-19b致胚胎心脏发育畸形及机制研究未见报道，本研究有源头创新性，可为早期先心病的防治提供新线索和潜在的干预靶标。

21. 立项依据 脊椎动物的心脏是胚胎发育过程中最早形成并行驶功能的器官，其发生需经由多细胞系特化、管状结构形成、最后精确组装成成熟4个心腔结构等发育过程，需要一系列重要的形态发生事件，包括细胞决定、细胞迁移和细胞分化等[1]，其间有多条信号通路（如Wnt 信号通路、Notch 信号通路等）参与其发育调控[2,3]，以保证胚胎心脏形成在时间和空间的协调发育。由于心脏的血液循环功能对脊椎动物的生存起关键作用，心脏发育畸形不但严重影响动物生后的宫外生活质量，而且常导致流产、死胎等[4]，因此有关胚胎心脏畸形的研究近年来受到普遍重视，并已成为预防医学领域疾病早期防治的一个热点研究内容。

22. 现已知，miRNAs 参与调控胚胎心脏的发育，在心肌细胞的生长及分化过程中发挥着极其重要的作用[5]。已有研究报道靶向敲除特异的miRNA 与心脏畸形密切相关，其中敲除小鼠的miRNA-1-2 导致50%小鼠发生室间隔缺损而死亡, 存活小鼠解剖发现心室穿孔[6]；敲除miRNA-133a-1/miRNA-133a-2 的小鼠胚胎发生心脏心室壁变薄和心室发育缺陷[7]；在敲除斑马鱼胚胎miRNA-138 的研究中，发现斑马鱼心房和心室发育异常，心肌前体细胞成熟受阻[8]。虽然上述与心脏畸形相关miRNAs 的研究已经取得了一些进展，但目前明确对胚胎具有心脏致畸作用的miRNAs 并不多，因而采用下一代测序或生物芯片等技术筛选与胚胎期心脏畸形相关的差异miRNAs，对其表达调控机制进行研究显得尤为重要[9]。

23. 近年来，采用下一代测序或生物芯片等技术主要用于筛选模式动物（斑马鱼、小鼠）胚胎期心脏畸形相关的差异miRNAs，未见文献对心脏畸形流产胎儿心脏组织相关的差异miRNAs 的筛选研究报道[5]。本研究小组利用我院产前超声诊断科对孕中期胎儿进行系统超声检查的优势，收集到超声筛查并确诊的胎儿左心发育不良孕妇（孕21w）3 例，家属从优生优育的角度要求流产；同时收集到未婚先孕来我院要求流产的同胎龄3 例正常胎儿的孕妇作为对照（见工作基础中图1），征得医院伦理委员会和孕妇家属的同意，对流产胎儿进行尸检并留取胎儿的心脏组织进行实验研究。我们在南方医科大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金（miRNA 在胎儿先天性心脏病中的差异表达研究，项目号：NFYKDX2010012，2010.1～2011.12，在研）的资助下，同时应用下一代

24. 测序和生物芯片技术对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织的miRNA 表达谱进行分析，结果均发现8 个miRNA 在左心发育不良流产胎儿心脏组织与正常对照之间存在3 倍以上的差异表达，并和real-time PCR 验证的结果一致（见工作基础中图2~6）。其中miRNA-19b 在进化上高度保守（见工作基础中表1）；在斑马鱼、犬、人的胚胎心脏发育早期及生后均有表达[11,12]；已有研究应用miRNA 芯片筛选成人扩张性心肌病人心脏组织发现miRNA-19b 表达异常的报道[10]；结合我们发现miRNA-19b 在孕中期左心发育不良胎儿心脏组织中表达明显上调，提示miRNA-19b在心脏发育早期起到重要的作用。我们采用体外合成miRNA-19b 前体显微注射入斑马鱼受精卵，结果发现受精后72 h 斑马鱼心脏扩大，心肌管未能环化，提示胚胎期miRNA-19b 过表达可致胚胎心脏畸形（见工作基础中图7）。鉴于miRNA-19b 致胚胎心脏畸形及其机制目前未见报道，因此有必要开展在体实验研究，并深入探讨其机制。

25. 前期研究中，本研究小组在南方医科大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金[miRNA 在胎儿先天性心脏病中的差异表达研究，项目号：NFYKDX 2009012，医学伦理号：粤妇伦字( 2009) 3 号] 的资助下，以孕21 周超声诊断为左心发育不良、自然流产的胚胎样本为研究对象，采用下一代测序技术，结合生物芯片的应用，以两种高通量技术同时筛选左心发育不良胚胎心脏中的差异miRNAs，结果发现在两种高通量筛选数据中同时出现的、3 倍以上的差异miRNAs 8 个，且real-time PCR 验证结果与其初筛结果基本一致（见工作基础中图1~8）。其中，人miR-19b 差异高表达于孕中期左心发育不良胚胎心脏组织中，且因：①该miRNA 在进化上高度保守（见工作基础中表1）；②斑马鱼、犬等多种生物的胚胎心脏中该miRNA 均有表达[10,11]；③miRNA芯片筛选研究发现，成人扩张性心肌病患者心肌重构的心肌组织中miR-19b 异常表达 [12]，均提示miR-19b 在心脏发育早期可能具有重要作用，而引起本研究小组的关注。

26. 鉴于斑马鱼是一种新兴的模式生物，不但胚胎小，而且拥有并不完全依赖心血管系统生存的生命特征（即使整个心血管系统缺失，也能通过氧的被动运输机制而生存，并继续发育一段时间），能为心脏发育研究提供极为有利的条件，是活体评估心脏发育相关基因功能的常用技术平台[13]，因此，我们首先体外合成用于人miR-19b 过表达研究的miR-19b 前体（miRNA-19b precursor，pre-miR-19b），显微注射入斑马鱼受精卵，来评估miR-19b 在胚胎心脏发育中的作用。结果发现，过表达miR-19b 导致斑马鱼出现心包水肿，心脏环化不完全，心房、心室结构异常（见工作基础中图9），初步获得了miR-19b 致胚胎心脏发育畸形的形态学依据。由于miR-19b 致胚胎心脏畸形及其机制目前国内外均未见报道，因此进一步论证miR-19b 与心脏发育畸形之间的关系、深入分析其分子调控机制就显得十分必要。

27. 现已知，心脏起源于中胚层，其胚胎时期的发生发育主要受Wnt 信号通路[2]、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路[13]、Notch 信号通路[3]等调控。其中，虽然BMP 信号通路与Notch 信号通路在胚胎心脏早期发生过程中起关键作用，但均需通过Wnt 信号通路来完成心肌细胞的特化，提示Wnt 信号通路在胚胎心脏发育中的重要作用。经典的Wnt 信号通路参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡等过程[2]，配体Wnt1 蛋白是其激动分子，当配体蛋白与细胞表面卷曲蛋白（Frizzled）家族的七次跨膜受体结合后，能够通过激活胞质中Dsh（dishevelled）蛋白，抑制GSK3β（glycogen synthase kinase 3β）的磷酸激酶活性，拮抗β-连环蛋白（β-catenin）的降解，使其在胞质中大量聚集，并进入细胞核结合TCF/LEF 家族的转录因子，从而激活下游不同靶基因如cyclin D 等，呈现其生物学效应[2]。因此，经典的Wnt 信号通路中，Wnt1 是该信号通路的启动因子，GSK3β是其功能的调节开关，而β-catenin 则是其功能的执行者。

28. 我们通过生物信息学对miRNA-19b 的靶基因进行预测[14]，发现Wnt 信号通路中关键蛋白Wnt1 为其潜在靶基因，两者的互补结合序列在进化上高度保守（见工作基础中图8）；本研究小组前期对孕鼠子代心脏发育异常的实验研究中，发现孕鼠子代心脏畸形与Wnt 信号通路密切相关[15]，因而我们联想到是否Wnt 信号通路也在miRNA-19b 致胚胎心脏畸形中起到重要的作用。我们进一步对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织中Wnt 信号通路中关键分子（Wnt1、GSK3β、β-catenin）的蛋白和基因水平进行研究，发现β-catenin 表达下调， GSK3β 表达上调，两者mRNA 和蛋白水平的变化幅度一致；而Wnt1 mRNA 表达不变，蛋白表达水平下调（见工作基础中图9），提示Wnt 信号通路在miRNA-19b 致胚胎心脏畸形中起作用，Wnt1 可能和miRNA-19b 直接结合，抑制Wnt1 的翻译，但不影响其转录，这和miRNA 通过碱基配对方式结合靶基因mRNA 的3′UTR，导致靶基因的翻译受抑制，但不影响其转录的特点是一致的[16]，但这并不能作为miRNA-19b 与Wnt1 直接作用的证据，为了确认Wnt1 是miRNA-19b 的直接靶位点，可以采用荧光素酶报告基因实验进行鉴定[17]。前期通过生物信息学预测发现Wnt1 启动子的一段碱基序列“UUUGCAC”和miRNA-19b上的保守序列“AAACGUG”互补结合（见工作基础中图8），这可用于进行荧光素酶报告基因实验揭示miRNA-19b 是否通过这个互补位点直接结合靶基因Wnt1，进而调控Wnt 信号通路。

29. 为探索miR-19b 致胚胎心脏畸形的可能机制，寻找深入研究的有用线索，我们进一步采用生物信息学分析的方法，来预测miR-19b 可能的下游靶基因。结果发现，Wnt 信号通路中关键蛋白Wnt1 为其潜在的作用靶点，且miR-19b 与靶基因Wnt1 的互补结合序列在进化上也高度保守、同源性达100%（见工作基础中图10）。由于：①心脏起源于中胚层，其胚胎时期的发生发育主要受Wnt、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、Notch 等信号通路的调控[2-3, 14]，BMP、Notch 信号通路尽管在胚胎心脏早期发生过程中起关键作用，但均需通过Wnt 信号通路来完成心肌细胞的特化，提示了Wnt 信号通路在胚胎心脏发育中的重要性；②本研究小组在先前国家自然科学基金（项目号30672245）资助下，开展孕期叶酸缺乏影响子代心脏发育的机制研究时，也证实了Wnt 信号通路调节异常与胚胎心脏发育畸形之间的密切关系 [15]，因此我们设想miR-19b 可能通过调控在种系进化上高度保守、在心脏发育早期极为重要的Wnt1 而发挥作用，以Wnt 信号途径为机制研究的切入点，有可能帮助我们揭示miR-19b 致胚胎心脏畸形的分子机制。

30. 现已知，经典的Wnt 信号通路参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡等过程[2]，配体Wnt1 蛋白是其激动分子，当配体蛋白与细胞表面卷曲蛋白（Frizzled）家族的七次跨膜受体结合后，能够通过激活胞质中Dsh（dishevelled）蛋白，抑制GSK3β（ glycogen synthase kinase 3β）的磷酸激酶活性，拮抗β-连环蛋白（β-catenin）的降解，使其在胞质中大量聚集，并进入细胞核发挥其生物学效应[2]。因此，经典的Wnt 信号通路中，Wnt1 是该信号通路的启动因子，GSK3β 是其功能的调节开关，而β-catenin 则是其功能的执行者。据此，我们以孕中期左心发育不良胚胎心脏组织为检测样本，采用Real time PCR、Western blot 技术，检测了Wnt 信号通路中几个关键分子（Wnt1、GSK3β、β-catenin）的基因、蛋白表达水平变化。

31. 结果发现，孕中期左心发育不良胚胎心肌组织中Wnt1、β-catenin 基因与蛋白表达均显著下调，GSK3β基因与蛋白的表达则显著上调，提示左心发育不良胚胎心肌组织中存在Wnt 信号通路明显受抑的现象。其中，GSK3β、β-catenin 在基因、蛋白表达水平的变化幅度基本一致，Wnt1 基因、蛋白表达水平的变化幅度则不一致，左心发育不良胚胎心肌组织中Wnt1 蛋白表达下调的程度更高（见工作基础中图11），符合我们的预期，此与miRNA与靶基因特异性碱基互补配对后主要抑制其蛋白翻译、不抑制其转录等特点相一致[16]。该研究结果提示，Wnt1 可能不仅仅是miR-19b 调控的下游靶基因，而且miR-19b 在致胚胎心脏发育畸形中的作用极可能通过影响Wnt 信号途径的机制来实现。鉴于上述预研结果尚不充分，还不能直接获得miR-19b 通过影响Wnt 信号途径导致胚胎心脏发育畸形的结论，如：miR-19b 在致胚胎心脏发育畸形中的作用尚应获得miR-19b 特异敲除实验结果的支持、通过荧光素酶报告基因的实验来提供miR-19b 调控Wnt1 的直接证据[17]等，因此以前期研究为基础、进一步较系统地论证其机制尤为必要。

32. 鉴于上述分析和我们已获得的研究结论，本研究拟以早期心脏发生中发挥重要作用的Wnt 信号通路为切入点，深入探讨miRNA-19b 致胚胎心脏发育畸形的机制。首先通过分析miRNA-19b 过表达或表达沉默时斑马鱼心脏发育情况（如心脏发育异常个体的百分比、心率）及对Wnt 信号通路的影响（原位杂交观察斑马鱼心肌中Wnt信号通路中相关基因Wnt1、GSK3β、β-catenin 的表达水平），获得miRNA-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形较充分的实验证据；继而分别构建Wnt1 与miRNA-19b 的过表达或沉默表达载体，通过双载体转染（“miRNA-19b 沉默+ Wnt1 过表达”或“miRNA-19b 过表达+Wnt1 沉默”） 观察斑马鱼心脏发育情况，论证miRNA-19b影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建miRNA-19b 表达载体和含野生型或突变体的Wnt1 启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入中胚层来源的P19 细胞，通过检测荧光素酶的活性及Wnt 信号通路中关键分子Wnt1、GSK3β、β-catenin 的基因和蛋白表达水平的变化，揭示miRNA-19b 对Wnt1 的调控机制。由于miRNA-19b 致胚胎心脏畸形及其机制研究目前未见报道，本研究具有源头创新性。研究若成功，将为阐明miRNA-19b 致胚胎心脏畸形的机制提供新的线索，为先天性心脏病在妊娠期的早期防治提供新的理论依据。

33. 鉴于上述分析和我们已获得的研究结论，本研究拟以早期心脏发生中发挥重要作用的Wnt 信号通路为切入点，深入探讨miR-19b 致胚胎心脏发育畸形的分子机制。首先通过观察miR-19b 过表达、表达沉默时斑马鱼心脏的发育情况（记录心脏发育畸形率、心率，心脏连续切片观察心脏超微形态）和Wnt 信号通路的变化（原位杂交检测斑马鱼心脏中Wnt1、GSK3β、β-catenin 的表达变化），从正反两方面获得miR-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形较充分的实验证据；进一步以Wnt 信号通路为切入点， 联合应用吗啡啉修饰的反义寡核苷酸（morpholino-modified antisense oligonucleotides，MO）技术和过表达技术，评判miR-19b 致胚胎心脏发育畸形的Wnt信号机制；通过构建miR-19b 表达载体和含野生型或突变体的Wnt1 3′ UTR 荧光素酶报告基因质粒，分别或共转染中胚层来源的P19 细胞（在1%DMSO 中可定向分化为具有搏动能力的心肌细胞，已作为心肌细胞模型广泛应用于心肌细胞发育的分子机制研究中）[18]，检测荧光素酶活性的变化及Wnt 信号通路中关键分子Wnt1、GSK3β、β-catenin 基因和蛋白表达水平的变化，来论证miR-19b 对Wnt1 的调控作用，以揭示miR-19b 对Wnt 信号通路的分子调控作用。

34. 由于miR-19b 致胚胎心脏发育畸形及其机制的研究目前未见文献报道，因此本研究具有源头创新性。研究若成功，将为阐明miR-19b 致胚胎心脏发育畸形的机制提供新的线索，可为先天性心脏病在妊娠期的早期防治提供新的理论依据和潜在的干预靶标。

35. 提问互动

36. （4）课题申请者有较好的科研基础与经验： 赵明，讲师，本课题负责人，承担本课题的设计及具体实施，一直从事围产医学的临床与科研工作；2003-2006 年间参与广东省自然科学基金资助项目（基于蛋白质芯片TORCH 检测新技术的研究，项目号：BK2003056）的研究，以共同第一作者发布SCI 论文2 篇{ “J Nanosci Nanotechnol，2008, 8（5）：2286~2292.”；Biosens andBioelectron，2008, 24（3）：376~382.}，获得广州市科技进步二等奖（项目号：20092704）；2005-2006 年间参与广州市医学科技发展重点资助项目（孕母叶酸缺乏对子代心脏发育及心脏WNT 信号转导途径的影响，项目号：ZKX05011）的研究，发现孕鼠子代心脏畸形与Wnt 信号通路密切相关，获得广州市科技进步三等奖（项目号：20092704）；目前正在参与国家自然科学基金资助项目（Folbp1 在胚胎期多氯联苯暴露致子代心脏发育缺陷中的作用及机制，项目号：30672245）的研究，进行斑马鱼胚胎期心脏发育相关的实验；正在主持南方医科大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金（miRNA 在胎儿先天性心脏病中的差异表达研究，项目号：NFYKDX2010012，2010.1～2011.12，在研）的研究，应用miRNA 测序和芯片技术同时筛选流产心脏畸形胎儿心脏组织中的差异表达miRNAs，发现miRNA-19b 表达均明显下调，并和Real-time PCR 验证的结果一致，为以后开展miRNAs 在心脏发育中的作用和机理研究提供了新的研究思路。近3 年以第一作者或共同第一作者发表论文11 篇，其中SCI论文3 篇，在围产医学研究领域有良好的研究基础。

38. 参考文献 1. Bajolle F, Zaffran S, Bonnet D. Genetics and embryological mechanisms of congenital heart diseases. Arch Cardiovasc Dis, 2009, 102(1):59-63. 2. Wang XY（王晓云）, Hua FT, Gu P, Chen RY, Liu YS. Folbp1 promotes embryonic myocardial cell proliferation and apoptosis through the WNT signal transduction pathway. Int J Mol Med, 2009, 23(3):321-330. 3. de la Pompa JL. Notch signaling in cardiac development and disease. Pediatr Cardiol, 2009, 30(5):643-650. 5. 赵明，王晓云，柳云松. 与心脏发育相关的miRNA 研究. 医学分子生物学杂志, 2010, 10(1):214-220. 7. Liu N, Bezprozvannaya S, Williams AH, Qi X, Richardson JA, Bassel-Duby R, Olson EN. microRNA-133a regulates cardiomyocyte proliferation and suppresses smooth muscle gene expression in the heart. Genes Dev, 2008, 22(23):3242-3254. 15. 刘琪，华飞，柳云松. 孕鼠叶酸缺乏对子代心脏叶酸结合蛋白1 基因及WNT 信号转导途径的影响. 实用儿科临床杂志, 2006, 21(13): 820-822. 16. Hendrickson DG, Hogan DJ, McCullough HL, Myers JW, Herschlag D, Ferrell JE, Brown PO. Concordant regulation of translation and mRNA abundance for hundreds of targets of a human microRNA. PLoS Biol, 2009, 7(11):e1000238. 17. Hu XH, Tian M, Bao J, Xing G, Gu X, Hua F（华飞）. Retinoid regulation of the zebrafish cyp26a1 promoter. Dev Dyn, 2008, 237(12):3798-3808.

39. 【拟解决的关键问题】 1、斑马鱼胚胎心脏发育畸形模型的建立： 斑马鱼胚胎心脏发育畸形模型的建立是本研究的关键问题之一。本研究小组在研究所已建立起斑马鱼研究平台，并熟练掌握斑马鱼受精卵显微注射、整体原位杂交等分子技术，不但已用于本研究小组先前一项国家自然科学基金（Folbp1 在胚胎期多氯联苯暴露致子代心脏发育缺陷中的作用及机制，项目号30973213）中有关斑马鱼的实验研究，而且还完成了本申请项目的预研工作，获得了过表达miR-19b 致斑马鱼心脏发育畸形这一重要形态学依据（见工作基础中图9），能够保证本申请项目的顺利完成。

40. 2、表达载体的构建： 为本研究的另一关键问题。本研究小组中王晓云已熟练掌握表达载体构建、细胞转染等工作，并已发表相关SCI 论文 [Wang XY（王晓云）, Hua FT, Gu P, Chen RY, Liu YS. Folbp1 promotes embryonic myocardial cell proliferation and apoptosis through the WNT signal transduction pathway. Int J Mol Med, 2009, 23(3):321-330.]，同时miR-19b表达载体现有多家公司可提供，技术上已有保障。 3、荧光素酶报告基因实验： 本研究小组中华飞在先前“维甲酸信号通路在斑马鱼胚胎发育中的作用机理”研究中，通过荧光素酶报告基因实验技术证实维甲酸与cyp26a1 启动子结合，已发表SCI论文[Hu XH, Tian M, Bao J, Xing G, Gu X, Hua F （华飞）. Retinoid regulation of the zebrafish cyp26a1 promoter. Dev Dyn, 2008;237(12):3798-808.]，同时荧光素酶报告基因质粒现有多家公司可提供，技术上也有保障。

41. （五）年度研究计划及预期研究结果 【预期研究成果】 1、获得miR-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形较充分的实验证据；论证miR-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；揭示miR-19b 对Wnt 信号通路的分子调控作用。 2、miR-19b 致胚胎心脏畸形及其机制研究目前未见报道，本研究具有源头创新性，将为阐明miR-19b 致胚胎心脏发育畸形的机制提供新的线索，可为先天性心脏病在妊娠期的早期防治提供新的理论依据和潜在的干预靶标。 3、本课题研究内容目前国内外均无类似报道，可填补该领域研究的空白。 4、发表2－4 篇高质量论文，其中2 篇为SCI 论文。 5、培养研究生2 名。

43. 【申请人参与科研项目情况】 1、韩林，赵明，彭云飞，董小艺，潘丰. 基于蛋白质芯片TORCH 检测新技术的研究，广东省自然科学基金资助项目（BK2003056），7.0 万元，2003.1-2006.12，已结题，本课题申请者参与该项目设计，为课题组主要成员。 2、王晓云，彭云飞，董小艺，潘丰，赵明. 孕母叶酸缺乏对子代心脏发育及心脏WNT 信号转导途径的影响，广州市医学科技发展重点项目（ZKX05011），4.0 万元，2005.1-2006.12，已结题，本课题申请者参与该项目设计，为课题组主要成员。 3、王晓云，赵明，彭云飞，董小艺，潘丰. 孕母叶酸缺乏对子代肺发育的影响及机制研究，广东省自然科学基金项目（项目号：BK2008079），7.0 万元，2009.1-2011.12，在研，本课题申请者参与该项目设计，为课题组主要成员。 4、王晓云，潘丰，赵明，彭云飞，董小艺. Folbp1 在胚胎期多氯联苯暴露致子代心脏发育缺陷中的作用及机制,国家自然科学基金项目（项目号：30672245），31.0 万元，2010.1－2012.12，在研，本课题申请者参与该项目设计，为课题组主要成员。

44. Thanks