Metodi separativi

1. Metodi separativi Elettroforesi Cromatografia idrodinamica (HDC) Frazionamento in Campo e Flusso (FFF)

2. BASI DI ELETTROFORESI Il campo di forze che causa il trasporto differenziale e' di tipo elettrico. L'elettroforesi ha avuto il suo ideale campo di applicazione in bioanalitica. La separazione si realizza in base al rapporto carica/raggio della molecola. ELETTROFORESI CON ELETTROLITA LIBERO Problemi di convezione ELETTROFORESI CAPILLAREELETTROFORESI CON SUPPORTO

3. Electrophoretic mobility • Voltage difference, E = voltage applied/distance between electrodes; generally expressed as volts/cm • Charge on molecule, q • Frictional component, f, determined by size and shape of molecule, pore size of matrix, viscosity of buffer Velocity of particle, v= Eq/f Mobility of particle, µ = v/E = q/f • Size/shape • Charge • Both size/shape and charge Separation can be effected by

4. = F z E F - D m = = z EX z V F F ext z V F = N J 2 T R = N 20 zV = F 96000 C / mol EFFICIENZA IN ELETTROFORESI Il campo forza elettrica per mole di molecole sara' dato da V=caduta potenziale Sostituendo si ottiene che: NUMERO DI PIATTI In condizioni ideali si ottiene che: Poiche' , V= 100÷50000V, z =1÷10 si ha che 6 N=2000÷10x10 ALTA EFFICIENZA

5. Types of zone electrophoresis • Filter paper electrophoresis: • Protein is easily denatured due to the high absorbance of filter paper. • Works for small peptides or amino acids. • Thin layer electrophoresis (TLC): • Chemical modified cellulose: cellulose acetate can reduce the absorbance of proteins. • Gel electrophoresis • Starch gel electrophoresis • Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) • Agarose gel electrophoresis • Capillary electrophoresis (CZE)

6. ELETTROFORESI SU SUPPORTO Aumento del rapporto superficie/volume Tipi di supporto: acetato di cellulosa carta gel di poliacrilammide (PAGE) agarosio I supporti danno un effetto di setaccio per separare in base alle dimensioni, uno volta che le specie siano state caricate in ambiente tamponato Esempi di applicazioni: Analisi di proteine (Progetto “Proteoma”) Sequenziatura del DNA (Progetto “Genoma”)

7. Electrophoretic migration V = IROhm law • Voltageis a function of currentand resistance • Resistance decreases during electrophoretic run, therefore current increases if maintaining constant voltage • Why minimize current increase during run? • As current increases, power increases- much of power is dissipated as heat • Heat affects electrophoretic separation- diffusion increases; samples can be sensitive to heat; buffer viscosity decreases therefore resistance decreases and uneven heating occurs due to best cooling at gel edges

8. ELETTROFORESI CAPILLARE L‘elettrolita e' all‘interno di un tubo capillare, la convezione e' soppressa dato l'alto rapporto superficie volume Il calore e' dissipato rapidamente: uso di alti voltaggi

9. Capillary Zone Electrophoresis (CZE) • Major drawbacks of gel electrophoresis: speed of analysis.  • Speed could be improved by increasing the electric current of the system. • Large amount of heat would be generated: high convection • CZE uses silica fused capillaries ranging from 0.150 to 0.375 millimeters in outer diameter to dissipate the heat produced. Increasing the electric fields produces very efficient separations and reduces separation times. • Verysmall amount of sample (0.1 to 10 nL) is required.  The sample solution is injected at one end and a electric field of 100 to 700 volts/centimeter is applied across the capillary.

10. CZE is unidirectional: electroosmotic flow • Because of charges on the inner surface of the capillary, buffer sweeps toward the cathode due to the electric field and carries on all the solutes • Electroosmotic flowdictates the direction and magnitude of solute ion flow within the buffer • All ions are then swept toward the cathode. • Negative ions will lead the neutral ions toward the cathode • Positive ions will trail the neutral ions as the cathode pulls them: ANIONS > NEUTRALS > CATIONS

11. CZE equipment • Detector • UV/Visible absorption • Fluorescence • Radiometric (for radioactive substances) • Mass Spec. • Capillary tube • Varied length but normally 25-50 cm • Small bore and thickness of the silica play a role • Using a smaller internal diameter and thicker walls help prevent Joule heating, heating due to high voltage

12. Cromatografia idrodinamica (HDC) • La HDC e’ una tecnica liquido-cromatografica a colonna impaccata. Il campo di applicazione e’ tipicamente <1µm • Una sospensione iniettata in un flusso di fase mobile attraversa la fase impaccata: le particelle piu’ grandi eluiscono prima delle piu’ piccole in quanto visitano vettori di velocita’ media piu’ elevati perche’ le loro dimensioni le escludono dalle zone di velocita’ piu’ lenta in prossimita’ delle pareti delle particelle che costituiscono l’impaccamento

13. Meccanismo separativo in HDC La tecnica FFF posside alcune similitudini con la HDC ma non e’ presente alcuna fase stazionaria

14. Frazionamento in Campo-Flusso (FFF) Acquisizione dati Registratore Pompa Iniettore Campo Fase mobile Flusso Canale FFF 0.123 Rivelatore UV/vis IN OUT sezione trasversale del canale FFF Collettore frazioni

15. Il canale FFF Ingresso del campione Campo esterno Flusso spessore w Detector Campione spessore w Flusso a profilo parabolico

16. Profilo flusso Cammino particella Campo Profilo flusso Flusso B A Come funziona la FFF?

17. Modi di operazione FFF Versatilità rispetto al peso molecolare dell’analita: Modo normale: macromolecole e nanoanaliti Modo sterico/iperstrato: sistemi microdispersi

18. Modo FFF normale trasporto indotto dal campo trasporto indotto dalla diffusione parete di accumulazione campo A A B B

19. campo campo Modo FFF sterico/iperstrato sterico B A iperstrato trasporto indotto da lift idrodinamico B A

20. Tipi di campo e tecniche FFF Versatilità rispetto al tipo di campione da analizzare: FlFFF: universale (dalle macromolecole alle microparticelle) GrFFF: nano e microparticelle

21. FFF a campo idrodinamico (FlFFF) Flusso in ingresso nel canale (iniezione del campione) Flusso trasversale Flusso in uscita dal canale (al rivelatore) Plexiglass Frit poroso Spacer Membrana Frit poroso Plexiglass Flusso trasversale

22. V µ 1/D r FlFFF in modo normale flusso trasversale flusso trasversale flusso di campione in uscita flusso di campione in entrata profilo parabolico C A B flusso trasversale in uscita

23. Legame covalente del fluoroforo via SiOEt3 Purificazione dal fluoroforo non legato Fluoroforo è legato alla matrice Size sorting FlFFF di nanosfere di silice derivatizzate • Nanoparticelle quali 3D scaffold per il fluoroforo • Energy transfer tra le unità di fluoroforo • Nanosensori FRET

24. Analisi di nanotubi di carbonio

25. diametro=20-30nm FlFFF di nanotubi: MWNT funzionalizzati idrosolubili Cicloaddizione 1,3-dipolare di azometina illide sul sistema p

26. V µ 1/D r FlFFF di buckyonions in sospensione

27. FFF a campo gravitazionale (GrFFF) Iniezione Uscita del campione Valvola di iniezione Blocco di Plexiglas Spacer Parete in vetro o plastica

28. Il nostro canale GrFFF…. Rheodyne injection UV/Vis detector On-channel injection Pump 15 cm

29. FACS map Q2: CD19(+) CD45(+) Burkitt lymphoma cells A B Q4: CD19(-) CD45(+) healty cells GrFFF-FC: selezione di cellule linfocitiche Sample: mixture of living human lymphocytes 20% (cell/cell) from Burkitt lymphoma cell line 80% (cell/cell) from healty donor

30. Injected cells: A:2.3*106 B:9.4*106 Normal (CD45+) vs. neoplastic (CD19+) lymphocytes

31. Injected cells: A:2.3*106 B:9.4*106 cell volume CD19 Normal (CD45+) vs. neoplastic (CD19+) lymphocytes

32. Prelievo di cellule linfoidi da aferesi di pazientein attesa di trapiantodi midollo Selezione e arricchimento di cellule staminali CD34+ 2.6% 10%

33. 6% 26.7%

34. 4.7% 58.3%

35. 7.3% 41.1%

36. 5.8% 19.2%

37. 3.7% 16.1%