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TEJIDO VECTORES mRNA DNA cDNA DNA digerido

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TEJIDO VECTORES mRNA DNA cDNA DNA digerido

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  1. Bibliotecas TEJIDOVECTORES mRNA DNA cDNA DNA digerido (doble cadena metilado) DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION EN CELULA HUESPED LIBRARY cDNA o genómica Bibliotecas cDNA BM 2009

  2. Estrategia general construcción biblioteca de expresión Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4 Paso 5 Paso 6 (if necessary) Vectores usados: lgt10 lgt11 lZAP lTriplEx Paso 7 Paso 8 Paso 9 Paso 10 Bibliotecas cDNA BM 2009

  3. T T T(30) Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA • Fuente de mRNA: • Alta relación secuencia interés/ mRNA total. • Baja tasa de degradación. • Métodos de enriquecimiento: • Uso de drogas para selección de líneas celulares • o estímulos específicos. • Fraccionamiento del mRNA o cDNA. • Clonado sustractivo. Preparación de poliA+ mRNA 3´A A A 5´ Bibliotecas cDNA BM 2009

  4. Random primers Oligo dT 5´cap 5´cap AAA(A)nA 3´ AAAAAA(A)nA 3´ mRNA mRNA Random primers TTTTTT(n)T AAA(A)nA AAAAAA(A)nA dATP dTTP dGTP dCTP dATP dTTP dGTP dCTP Transcriptasa reversa Transcriptasa reversa AAA(A)nA AAAAAA(A)nA AAA(A)nA AAAAAA(A)nA cDNA:mRNA cDNA:mRNA Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA Transcriptasas reversas (RT): DNA pol RNA dependiente ALV (Avian leukemia virus) y MoMLV (Moloney strain of murine leukemia virus) Bibliotecas cDNA BM 2009

  5. Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA Por reemplazo Transferasa terminal AAAAAA(A)nA AAAAAA(A)nA dNTPs RT con oligo dT RNAasa H: nicks mRNA en mRNA:DNA DNA pol TTTTTTTTTT AAAAAA(A)nA Degradación RNA TTTTTTTTTT Transferasa terminal dCTP CCCCC TTTTTTTTTT Fragmento Klenow dNTP´s + oligo G cDNA doble cadena GGGGG AAAAAAAAA CCCCC TTTTTTTTTT cDNA doble cadena Bibliotecas cDNA BM 2009

  6. Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores. Bibliotecas cDNA BM 2009

  7. Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador. Bibliotecas cDNA BM 2009

  8. Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores. Fosforilación de los fragmentos antes de ligar al vector Bibliotecas cDNA BM 2009

  9. Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA Esquema para la construcción de una biblioteca full-length Bibliotecas cDNA BM 2009

  10. Fago l: Mapa génico Brazo izquierdo Brazo derecho Región central Cos Cos Bibliotecas cDNA BM 2009

  11. Fago l: Ciclo de vida Activates C2 protein Baja [C1] Alta [C1] Bibliotecas cDNA BM 2009

  12. Fago l Formación placas de lisis Ensamblado del bacteriófago Bibliotecas cDNA BM 2009

  13. Construcción de vectores l • Vectores: dejaron el 60 % del genoma l salvaje (crecimiento lítico) • Tamaños que se empaquetan eficientemente: 105-78 % del genoma (10-20 kpb) • Elección del vector: • ER empleada. • Tamaño del fragmento a ser insertado. • Expresión del cDNA en bacterias. • cDNA debe ser “rescatado” del vector l en forma de plásmido. Bibliotecas cDNA BM 2009

  14. Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago l Vector desfosforilado Relación molar alta [Vector / inserto] Extremos no compatibles Ligación Selección-Screening Bibliotecas cDNA BM 2009

  15. CI CI l gt10: 5-11 kb Marcador de selección de fagos recombinantes: CI gen CI Lisogenia Lisis Esquema: cDNA- EcoRI lgt10-EcoRI Cepas E. coli hfl– (mutantes proteasa Hfl) NO degrada CII S! CI lisogenia Fagos CI D forman placas de lisis en cepas hfl- Ligación Empaquetamiento in vitro Infección E. coli hfl- Plaqueo en top agar Formación placas de lisis (amplificación) Screening hibridización sondas Bibliotecas cDNA BM 2009

  16. Plaqueo en top agar y formación placas de lisis Screening biblioteca: Hibridización con sondas Bibliotecas cDNA BM 2009

  17. EcoRI l gt11: 7 kb plac lacZ Inserción cDNA en EcoRI Proteína de fusión CI 857: mutante inactivo del represor a 45ºC S 100: mutación ambar en el gen S lisis Screening biblioteca de expresión: Inmunodetección Infección cepa E. coli SupF Incubación 10-15´ a 45ºC Inducción ciclo lítico Esquema: cDNA- EcoRI lgt11-EcoRI Ligación Empaquetamiento in vitro Infección E. coli Plaqueo en top agar. Incubación a 42ºC Formación placas de lisis Screening recombinantes IPTG/X-gal Screening inmunodetección- Hibridización sondas Bibliotecas cDNA BM 2009

  18. l ZAP: 7 kb Esquema: cDNA (EcoRI/XhoI) lZAP (EcoRI/XhoI) pBluescript SK- Ligación Empaquetamiento in vitro Infección E. coli Plaqueo en top agar Formación placas de lisis Screening inmunodetección Clones positivos Recuperación de los clones positivos: Clon l recombinante positivo + M13 fago helper mutante XhoI SupE- lR I T EcoRI LB-Amp XL1-blue MRF´ SupE Bibliotecas cDNA BM 2009

  19. Ribosome Binding Site (RBS) Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG mRNA AUG UAAGGAGG AUUCCUCC 5’ 3’ 3’ 5’ 16S rRNA small ribosomal subunit l TriplEx: expresión en tres marcos de lectura Bibliotecas cDNA BM 2009

  20. Pasos 9 y 10: Screening e identificación de los clones. Bibliotecas cDNA BM 2009