1 / 78

4.B L M

GEN ISLEVININ AIKLANMASI . TRANSLASYON = Amino Asit Dizilimine evrimBu kisimda proteinlerin biosentesi incelenecektir. Bu sre m-RNA'daki nkleotid lisanindaki bilgilerin aminoasit lisanindaki bilgiler halinde proteine evrimini kapsar. Bu sre santral dogmanin son basamagidir.Btn proteinl

walker
Télécharger la présentation

4.B L M

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

    1. 4.BLM

    2. GEN ISLEVININ AIKLANMASI TRANSLASYON = Amino Asit Dizilimine evrim Bu kisimda proteinlerin biosentesi incelenecektir. Bu sre m-RNAdaki nkleotid lisanindaki bilgilerin aminoasit lisanindaki bilgiler halinde proteine evrimini kapsar. Bu sre santral dogmanin son basamagidir. Btn proteinler dogal olarak mevcut (20) amino asitten olusur. Buna bir istisna olarak seleno sistein gsterilmektedir. Bu yapi sisteindeki slfr atomunun selenyumla yer degistirmis formudur. Bazi bakterilerde bu olusuma rastlanmistir. Bunun disinda diger dogal olarak mevcut amino asitler (a.a) alfa ( a ) a.a olarak adlandirilir. nk bunlarda karbonlardan alfa ( ? ) karbon diye bilinen karbon amino grubunu ve karbonsit (asidik) gruburu hidrojeni ve yirmi farkli radikal kk = (yan zincir grubunu) tmn kendine baglar. Teknik olarak proline a.a yapisindan dolayi imino asit olarak adlandirilir. Amino aside eklenen bu drt unsur amino asidin chirality (zgn yapi) denen zelligini saglar.

    3. Amino asidi olusturan bu drt unsurun [szgelimi sol eldiven sag eldiven ayna grnts gibi] pozisyonlari onlara sahip olduklari zelliklerini saglar. Optikal zelliklerden dolayi bu iki sekil ( D ) sembol ile gsterilen Dextrorotatory (saga dnsl) ya da (L) sembol ile gsterilen Levonatry (sola dnsl) olarak adlandirilir. Proteinler yada polipeptitler iki amino asit arasindaki peptit bagi ile meydana gelir. Bu durumda uzun amino asit zincirleri bir proteini olusturmak zere birlestiklerinde residues (kk) adini alir ve bu birlesmede tm zincirler bir amino (N ieren u) ve karboksil (C ieren u) ucuna sahiptir. Polimerlesmis amino asit dizilimine proteinin primer yapisi denir. Sistein kkleri arasinda dislfit kprlerinin sekillenmeside primer yapi iinde dsnlr. Polipeptitler bir ok kereler katlanarak proteinin sekonder yapisini olusturur. Bu katlanma bazen diger proteinlerin denetiminde olmak zere kendiliginden gereklesir Daha ileri dzeyde katlanma boyutlu yapida proteinin tertiar yapi denilen alfa sarmal beta levha gibi yapilari olusturur. Birok protein aktif halde iken birok alt nitenin bir alt nitenin bir araya gelmesi ile olusur ve bu yapiyada proteinin quaternary yapisi denir. Translasyon ise proteinlerin primer yapisinin mRNAdaki nkleotit dizilimi ile belirlenmesini tanimlar.

    4. BILGININ NAKLEDILMESI Translasyonun ayrintilarina girmeden nce bazi terimlere iliskin aiklamalar yararli olacaktir. Protein ve ribozomal (RNA) dan ibaret olan ribozomlar protein sentezi yeridir. Gendeki bilgi mRNA formldedir. Bu bilgi nkleotitlik gruplar (kodon) halinde bulunmaktadir. Kodonlar amino asitleri belirler. Ribozoma getirilen amino asitler ( aa ) (tRNA)ya eklenir. (tRNA)larin ( aa ) eklenme yerinin aksi tarafinda yer alan antikodon adi verilen kodondaki nkleotitlere btnler yapilari bulunur. Peptit bagi ribozomda hazir bulunan bir tRNAdan bosalan (aa) ile uzamakta olan amino asit zincirindeki son amino asit arasinda olusur. mRNA daha sonra bir kodon ileri gider ve sre bylece ilerler bu dng polipeptit boyunca tekrarlanir.

    5. Transfer RNA Amino asitin transfer RNAya eklenmesi t-RNAnin grevi her amino asidi mRNAdaki belli bir zel kodona denk gelecek sekilde proteine eklemelidir. tRNA bu grevi yapisi sayesinde saglar. tRNAnin bir ucunda antikodon diger ucunda aminoasit ekleme yeri vardir. Uygun amino asit yani antikodona uygun (a.a) tRNA ya amino ail tRNA sentetaz enzim (mesela arginin tRNA sentetaz) leri araciligi ile eklenir. Eklenmis amino asitli tRNAya yklenmis tRNA denir Amino ail tRNA sentetaz ilgili zel amino asidi tRNA ya enzim yzeyinde olusan iki basamakli reaksiyonla ekler. Birinci safhada aminoasit ATP ile aktive edilir.Ve amino ail adenilik asit meydana gelir( aa in karboksil grubu ile ATP nin 5.fosfat i arasinda kovalen bag kurulur) Ikinci safhada aminoasit yksek enerjili bagla riboz sekerinin ikinci ya da nc karbonu ile (tRNA) nin nc (3) ucundaki adenine kovalen bagla baglanir. Ilgili sekilde yksek enerji baglari hidrolize oldugunda bolca serbest enerji saglanan bag olarak ~ sembol ile gsterilmistir. Bu nedenle protein sentezi srecinde peptit bagi olusumu iin gerekli enerji ihtiya oldugunda peptit bag sekillenme yerinde hazir olacaktir.

    6. UNSUR SAYISI Bakterilerde herbiri bir (aa) iin 20 amino ail tRNA sentetaz bulunur. zel enzim zel (aa) yi ve ilgili (aa)i kodlayan (tRNA)lari tanir. Eukaryotlarda (20) sitoplazmik ve 20 mitokondrial olmak zere ayri ayri sentetaz enzimi bulunur. Bunlarin tm ekirdekte kodlanir.hucrede 20 a.a. Oldugu halde ,l sifre varsayimi ile 64( noktalama iin geriye 61 kalir) kodon mumkun oldugu halde wooble hipotezi nedeniyle 32 farkli amino ail sentetaz bulunuldugu ancak bunlarin 20 sinin ozgun oldugu dusunulmektedir

    7. Sekil 1. Proteinlerde bulunan (20) amino asit. Fizyolojik (pH) de amino asitler iyon olarak bulunur. Degisik (R) gruplarinin siniflandirilmasina dikkat ediniz.Burada ve bir harfli gsterim kullanilmistir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    8. Sekil 2. Iki aminoasit arasinda peptid bagi olusumu. Bir aminoasidin karboksil grubu ile digerinin amino grubu arasinda bag olusur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    9. Sekil 3. Iki sistein karsi karsiya geldiginde dislfit bagi sekillenir. Eger iki amino asit serbest formda ise olusan yeni yapi sistindir. Iki sistin ayni yada farkli polipeptidde ise Di slfit kprs istikrari (stabiliteyi) saglar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    10. Sekil 4. Fosfo Glyserat Kinaz enzimi iin proteinlerin (3) farkli canlandirilma sekli sol tarafdaki (bag) yapisina iliskin diyagramda btn hatlar molekln degisik atomlari arasindaki baglari gsterir. Ortadaki serit diyagraminda proteinin sekonder yapisi vurgulanmistir. Burada alfa sarmal (spiral sarmal) ve Beta pileli (kirma, pliseli) yapi (dz ok biiminde) gsterilmistir. Son olarak da sagda uzaysal boyutlu diyagram ieren molekller izim biimindedir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    11. Sekil 5. Ribozomda translasyon srecinin baslamasinin gsterimi iki yollu (tRNA) yalara eklenmis amino asitler arasinda (ilk) peptit bagi sekillendirmek zere olusturduklari pozisyonlara dikkat ediniz. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    12. Amino ail tRNA sentez enzimleri heterojen enzimler grubuna girer. E.Coli de retile protein monomer proteinlerdir. (bir alt nite) her iki alt nitenin her birimini iki kopyadan olustugu tetremerik proteinlere kadar esitli proteinler bulunur. Enzimler Dizilis sira benzerligi, Yapisal zellikleri ve Amino asitlerin tRNAnin nc adenosin ucunun nc hidroksiline (3-OH) (II sinif enzimler) Yada ikinci hidroksile (2-OH) (birinci sinif enzimler) baglanip baglanmadigina gre iki sinifa ayrilirsa uygun amino asidi uygun tRNA ya eklemek iin sentetaz enziminin (tRNA) nin birok parasini tanimasi gerekir. Bu olgu (tRNA)daki bazi zel degisikliklerin yere ynelmis mutagenez (site-directed mutagenez) ile degisiklikler yapilmasi saglayan denemeler ile belirlenmistir. E.Colinin (20) sentetazindan on yedisinde tanima sreci antikodonun kisimlarinin taninmasini ierir. Bu durum antikodonun protein sentezinde tRNAnin belirleyici elemani olmasinin dogal sonucudur. Sentetazlar nce bazi hatalar yapip yanlis amino aside baglanabilir. Sz gelimi izolosil (tRNA) sentetaz 225 defada bir defa valine birlesebilir.

    13. Sekil 6. zel aminoasidin kendi (tRNA)sina baglanmasi amino ail sentetaz yardimi iki basamakli bir islemle saglanir. Yksek enerji baglari ~ sembol ile gsterilir. Ilk safada aminoasit yksek enerji bagli (AMP) ye eklenir. Ikinci safhada yksek enerji bagi (tRNA) ya geirilir bu isleme yklenme denir. Hangi esit aminoasil tRNA sentetaz sz konusu olduguna gre aminoasitler Adenosinin nc (3) ucundaki sekerin ya ikinci (2) ya da nc (3) atomuna eklenir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    14. PROTEIN SENTEZINDE AMINOASIT t-RNA BIRLIKTELIGININ TANINMASI Aminoasitler protein sentezine t RNAlara eklenmis olarak girmekteysede teorik olarak aminoasitlerin kendisininde translasyon srecinde ribozomlarca taninabilmesi mmkndr. Bu konuda yapilan basit bir deney aminoasidin ya da tRNA nin hangisini tanidigini belirtmistir. 1996da F.Chapeville ve arkadaslari sisteine baglanan (tRNA) yi izole etmislerdir. Arastiricilar kimyasal olarak Raney nikeli adi verilen sisteinden (SH) grubunu uzaklastiran katalitik nikel formunu kullanmak suretiyle Sisteini Alanine evirmislerdir. Bu (tRNA)lar protein sentezinde kullanildiginda Alanin Sisteinin olmasi gereken yere birlesir. Bu durum aminoasitin degilde tRNAnin protein sentezinde tanindigini gsterir. Sentetaz aminoasidi zel (tRNA) ya ekler. Bylece protein sentezinde (tRNA) daki antikodonun (aminoasidin kendisi degil) hangi amino asidin hangi sira ile birlesecegini belirledigi anlasilir.

    15. Sekil 7. Sistein (tRNAcys) Raney nikeli muameli edilirse Sisteindeki (SH) grubu uzaklastirilir ve alanin (tRNAcys)e dnsr. Protein sentezinde alanin proteindeki sistein yerine birlesir. Bu durum aminoasitlerin proteine birlesmesi konusundaki zgnlgn (tRNA) ya ait oldugunu gsterir. nk tasidigi aminoasit sistein degil Alenin oldugu halde gene tRNA islevini yapmis ribozomca taninmistir, yani taninmada tasidiga yk degilde tasiyicinin niteligi nemli olmustur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    16. Sekil 8. A) Haberci RNAnin normal olusmasinda kodonlar tekrarlanarak (CAU) olarak okunur ve bu da histidini kodlar. B) (mRNA)nin okuma erevesindeki bir basamakli kayma kodonlarina tekrarlanan (AUC) gibi okumasina yol aar. Bu ise izolsini kodlar. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    17. Sekil 9. Metiyonin ve N.Formil Metiyoninin Yapisi (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    18. BASLATMA KOMPLEKSLERI Translasyon sreci safada incelenir. Bu safalar1-) baslatma, 2-)uzatma ve 3-) bitirmedir. Uzatma sreci byyen peptit zincirini ardisik biimde amino asit ekleme isleminin tekraridir. Protein sentezini baslangicinda ve bitiminde eklenme komplexligi sz konusudur. Translasyon sreci basladiginda nkleotidlik harf grubundaki (kodonu) bilginin tercme edilmesi edilmesi (aminoasit cinsini gsteren bilgiye evrilmesi) sz konusudur. mRNAnin okunmasi srecinde bir baz erken ya da ge baslarsa okuma erevesi degisirse tamamen farkli kodonlar elde edilmis olacaktir. Neticede genin kodladigi protein ya da ona benzer biimde retilen proteinin belli bir yapisal islevi yerine getirmesi ya da getirmemesi sz konusu olacaktir. N-Formil Metiyonin Grevi :E.Coli deki her esit proteinin sentezi N-Formil metiyonin adindaki modifiye aminoasitle baslar. Ancak E.Colideki tamamlanmis proteinlerin hibiri N-formil metiyonin iermez. Hatta proteinlerin ogu ilk amino asit (aa) olarak metiyonun bile iermez. Bu durumda protein fonksiyonel hale gelmeden nce, ilk retildikten sonra, baslangi aminoasidi modifiye edilmekte ya da uzaklastirilmis olmaktadir Eukaryotlarda baslangi aminoasidi metiyonin olup N-formil grup iermez. Metiyonin (5-AUG-3) kodonuna sahip olup bu kodon baslatici kodon olarak bilinir. Metiyonine iliskin ayni btnler antikodona (3-UAC-5) sahip iki (tRNA) bulunur.

    19. Translasyonun Baslatilmasi Prokaryotlarda ribozomun (30(S) ve 50(S) alt niteleri translasyon srecinde degiller ise bir birlerinden genellikle ayri ayri haldedir. Translasyonu baslatmak iin nce asagidaki unsurlara sahip baslatici kompleks sekillenir. Bu komplex yapida ; 30(S)lik kk oln ribozom alt nitesi , mRNA ykl N-formil metiyonin tRNA (fMET-tRNAf met) ve ana baslatma faktr (IF1, IF2, IF3) unsurlar bulunur. Baslatma faktrleri, uzatma faktrleri ve sonlandirma faktrleri protein olup ribozoma gevsek biimde ilismistir.

    20. Sekil 10. E.Colide Metiyonin iin iki tRNA a) Baslatici tRNA ve b) isel tRNA. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    21. Bu unsurlarin varligi ribozomlar izole edilip protein sentetaz yetenekleri kaybedince yapilan arastirmalar ile belirlenmistir. Baslatici komplex olusturan unsurlar bir ok basamakli bir srele karsilikli etkilesime sahiptir. Bu interaksiyon niteligi tamamen anlasilmamisdir. Sadece (IF3) n 30(S) lik ribozom alt nitesine baglanarak bu 30(S) lik alt nitenin (mRNA)ya baglanmasini mmkn kildigi bilinmekteder. ( Sekil 11-birinci safha ). Ayni anda IF2 ykl N-Formil metiyonun tRNA ( fMet - tRNAf met) ve GTP (Guanosin Trifosfat) ile birlikte bir komplex olustuur. Baslatici( f met tRNAyi) ribozoma getiren unsur IF2 dir. Ayrica IF2 yardimi ile (GTP) nin (GDP + Pi ) biimine hidrolize olmasi ile muhtemelen 30 S ile birlikte olan baslama kompleksinin 50(S)lik ribozomal alt nitesine eklenmesine bylece tam ribozom sekillendirilmesine dolayisiyla ardindan baslatma faktrleri ve (GDP)nin birakilmasina olanak verir. Translasyon srecinde hidroliz (GTP) nin biimini degistirir ve 70(S) lik partikel sekillendikten sonra ribozomdan baslama faktrlerinin birakilmasini saglar. Bylece translasyonda (GTP) nin hidrolizi kovalent bag olusumundan ziyade conformational (sekilsel, biimsel) degisim iindir.

    22. Sekil 11. basamakli sre ile 70(S) lik prokaryotik ribozom sekillenmesi: ilk basamakda 30(S) ribozom ve mRNA birlesir. Ikinci basamakda baslatici tRNA (IF2) ile birlesir. Son safada 70(S) ribozom sekillenmesinin ardindan bir ve 2 ci safadaki unsurlar birleserek baslatma komplexi sekillerdirler. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    23. Eukaryotik baslatma faktrleri kk harf (e) semboln iererek belirtilir. (eIF1, eIF2, eukaryotik initation factr=Eukaryotik baslatma faktr). Sadece eukaryotlarda bulunan zel sapka(cap=kep =7 metil guanozin) baglama proteini (eIF4E) gibi unsurlarda dahil enazindan onbir baslatma faktr sz konusudur. Prokaryotik (mRNA) ile Ribozom yapisinda yer alan16(S)lik ribozomal RNAnin btnlerligi baslatma komplexi sekillenmesinde onemli adimdir. Yani haberci (RNA) zerindeki baslatma dizilimi (AUG)den az yukari yndeki blge (Shine Delgarno dizilimi)arasindaki btnlerlik sayesinde ribozomun kendi ilgili m RNA tarafindan taninmasi saglanir. Bu olgu bu konuyu ilk neren arastiricinin adina izafeten Shine Delgarno hipotezi diye bilinir.Haberci RNA ile 16(S) lik ribozamal RNA arasindaki btnler (AGGAGGU) dizilimi Shine-Delgarno dizilimi diye adlandirilir. Prokaryotik ve Eukaryotik robozomal (RNA)lar arasinda byk lde homolog olmasina ragmen Shine-Delgorno dizilimi Eukaryotlarda yoktur. Eukaryotlarda ise ayni surecde mRNA nin 5 ucunda 7 metil guanosin sapkasinin kucuk ribozomal alt iuniteni kisimlarinca sozu edilen sapka (CAP=kep) dizilime butunler kisimlarca taninma soz konusudur Eu karyotlarda bu dizilime bulanin adi ile Marylin KOZAK diizilimi denir

    24. Ribozomda Aminoasil ve Peptitil Yerleri Baslatici tRNA kendisine ilismis mRNAli prokaryotik ribozomu 30(S) lik alt nitedeki iki yerden birine uyar. Ribozomdaki bu iki yer ya da bosluk aminoasit yeri (A.yeri) ve peptidil yeri (P yeri) olarak adlandirilir. Her yer peptit bagi olusmadan nce tRNA ierir. (P) yer byyen peptit zinciri ile tRNA ierir. (A) yeri ise bir amino asitli tRNA (amino asit t-RNA) ierir. 70(S) ribozom sekil (11) deki gibi tamamlaninca baslatici unsur (fMet- tRNAf met) direk olarak (P) yerine yerlesir. Buraya sadece ykl tRNAnin yerlesmesi sz konusudur. tRNA ve Ribozomun bir araya gelmesi btn t-RNAlarin nc (3 CCA )ucu ve 23 (S)lik ribozomal RNA daki guanin yardimi ile saglanir.

    25. Sekil 12. Shino-Delgarno hipotezi. Prokaryotik (mRNA)nin baslatici kodonunu yukari ynnde nnde yer alan genellikle AUG olan Shine-Delgorho Dizilimi (AGGAGGU) bu dizilim ile 16(S) ribozomal RNAnin nc ucu (3) arasinda (UCCUCCA) btnlerlik vardir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    26. Sekil 13. 70(S) lik ribozomun ierdigi (A) ve (P) yeri bu yerler (tRNA) lar iindir. mRNA bu yerlerin asagisinda islev grr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    27. UZAMA SRECI Ikinci tRNAnin Pozisyon Almasi Prokaryotik translasyonun ikinci safasi ikinci tRNAnin pozisyon almasidir. Bu islem (A) yerindeki kodonca belirlenir. Ikinci tRNA ribozomun (A) yerinde kendi antikodonu ile mRNAnin ikinci kodonu arasinda hidrojen bagi olusturacak sekilde yer alir. Bu basamak dogru tRNA, diger bir (GTP) ve uzatma faktrleri (elongation factr) denilen EF-Ts ve EF-Tu sembol ile gsterilen iki olusuma ihtiya gsterir GTPye baglanan Ef-Tu olusumu (t-RNA)nin ribozomdaki (A) yerine yerlesebilmesi (pozisyon alabilmesi) islemini saglar.

    28. Sekil 14. Ef-Ts/Ef-Tu Dngs : Ef-Ts ve Ef-Tu olusumlari (t-RNA)nin ribozomdaki (A) yerine ilismesi iin gereklidir. Seklin orta yukarisinda GDPye ilismis Ef-Tu unsuru gsterilmistir. GDP daha sonra Ef-Ts ile yer degistirir neticede. GTP ile degisim vukubulur. Eklenen tRNA ribozoma gelir. Eger kodon antikodon uyumu dogru ise tRNA (A) yerine GTPnin (GDP ve P1) ye hidrolizi yardimiyla yerlesir. Bu durumda Ef-Tu birakilir. Ef-Tu basladigi yere geri gider. Ef-Tu GDP iin gl bir affinite(uygunluk yarayislilik) gsterdiginden Ef-Tsnin rol GDPyi daha sonra (GTP) ile degistirmektir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    29. tRNA pozisyon aldiktan sonra GTP yapisi (GDP + P1) ye hidrolize olur. GTPnin hidrolizi zerine (Ef-Tu/GDP) kompleksi ribozomdan serbest birakilir. (Ef-Ts) ise yeniden (Ef-Tu/GTP) kompleksi olusturmak iin gereklidir. Ef-Ts ile GDP yapisi (Ef-Tu) zerinde yer degistirir. Daha sonra yeni GTP ile Ef-Ts yer degistirir. Sonra EF-Tu/GTP kompleksi diger (t-RNA)ya baglanir. Burada da tekrar (GTP) hidrolizi ile (GTP) nin seklinin degistirilmesi ve (A) yerindeki (tRNA) oldugunda (Ef-Tu GDP) kompleksinin hareket etmesi mmkn olur. GTP nin hidrolize olmasi birka mili saniyeyi gerektirir. Bylece (Ef-Tu/GDP) nin ribozomdan ayrilmasi ve diger birka mili saniyede Ef-Tu/GDPnin burda kalmasi saglanir. Bu iki zaman araliginda dogru (tRNA) yerinde ise peptit bagi sekillenir. Dogru t RNA yerinde Degil ise ykl (tRNA) uzaklastirilir ve yeni (Ef-Tu/GTP) araciliklikli (tRNA) test islemi baslar. Hata orani proteine baglanan onbin (aa) da bir tane (aa) seklindedir. Aminoasitler birlesme hizi ise her saniyede 15 (aa)dir. Eukaryotlarda bu bu saniyede (2-5) dir.

    30. Sekil 15. Iki (t-RNA) eklenmis ribozom: Bu durumda fenil alanin aminoasidi iin ikinci kodon (UUU) sz konusudur. Iki aminoasit bir digerine bitisiktir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    31. PEPTIT BAGI SEKILLENMESI Iki (tRNA) zerindeki iki aminoasidin bu ikisi arasinda peptit bagi olusacak sekilde bir pozisyon almasi ile sz konusu olmaktadir. Her iki aminoasit enzim merkezindendir. Yanyana gelmesi ile peptidil transferaz enzimi yardimi ile peptid bagi olusur. Bu enzim 50(S) lik alt nite zerinde yer alan amino asitler arasinda peptit bagini olusturur. Bu enzimatik merkez 50(S) lik alt nitenin tam bir kismindan olusur. Eskiden bu merkezin birok 50(S) lik protein paralarindan mtesekkil oldugu dsnlyordu. Gnmzde ribozomun rRNAsinin enzimatik aktivitesi ve ribozomik aktivitesini sz konusu oldugu dsnlmektedir. Enzimatik aktivite N-formil metiyonin karboksil ucundan bir bagin ikinci amino asidin (Sekil 16da fenil alanin) amino ucuna tasinmasini saglamaktadir. Her ardisik peptit bagi aminoasidin cinsine bakmaksizin aynidir. Kullanilan enerji (P) yerindeki (t-RNA) ile onun aminoasidi arasindaki mevcut yksek enerjili ester bagidir. Peptit bagi olusturduktan hemen sonra dipeptitli (t-RNA) unsuru (A) yerinde edilen (t-RNA) ise (P) yerindedir

    32. TRANSLOKASYON Uzama srecinin ikinci safasi ribozomun (t-RNA) ve (m-RNA) ya gre yer degistirmesidir. Bu translokasyon (tasinip yerdegistirme) islemi uzatma faktrleri (Elangation Factors =Ef-G) araciligi ile yapilir. Eskiden bu faktrlere translokaze adi verilmekteydi. Bu durumda ribozom zerinde bir nc (t-RNA) yeri tanimlamak gecikecektir. Bu yeri ikis yeri (exit=E yeridir. Ribozomlar (Ef-G) unsuru yardimiyla fiziksel olarak m-RNAyi ve buna eslik eder (t-RNA) yi hareket ettiremez. Translokasyon sonrasi halden translokasyon ncesi hale dnerler. Bu hareket GTPnin GDPye hidrolizi ile saglanir. Ilk translokasyon sonrasi duruma getikden sonra (E) yerinde tketilen tRNA disari salinir. Bylece ribozom yeni bir ykl (tRNA) yi (A) yerine alacak hale gelir. Ribozomlar bu (t-RNA) yerine iliskin yapisina bilgisayar destekli izimlerde (Sekil 17de) gsterilmistir. Eukaryotlarda uzatma faktr prokaryotlardaki EF-Tu, EF-ts ve EF-Gnin islevini grr. [eEF1 ?] eukaryotlarda yapi olup prokaryotlardaki (EF-Tu) islevini grr. Ayni sekilde Eukaryotlardaki (eEF1 ? ? ) unsuru EF-Tsyi ve (eEF2) ise EF-G yi temsil eder.

    33. Sekil 16. Ribozom zerinde N-formil metiyonin ve fenil alanin arasindaki peptit bagi sekillenmesi ilk amino asidin t-RNAsindaki karboksil ucuna ilisen bag ikinci amino asidin amino grubuna ilk (t-RNA) simdi bosalmis olup ikinci (t-RNA) eklenmis dipeptitte sahiptir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    34. SONA ERDIRILME (TERMINASYON=TAMAMLANMA) Anlamsiz (Non-Sense) Kodonlar Hem prokaryotlarda ve hem Eukaryotlarda tamamlanma srecine iliskin sre ribozomun (A) yerinde anlamsiz kodondan biri belirince saglanir. Bu kodonlar bazen amber adiyla bilinen UAG, bazen ochre adiyla bilinen UAA ve bazen Opal adiyla bilinen UGAdir. Amber ya da kahverengi tas Kaliforniya Teknoloji enstitsndeki R:H.Epstein Laboratuvarindaki (UAG) kesfinde grev alan lisansst grencisi Bersteinin isminin ingilizce karsiligidir. Prokaryotlarda tamamlanma srecinde rol alan protein sonlandirici serbest biraktirici faktr (Releasing Factr = RF) olarak adlandirilir. Ayrica sonlandirmada GTPnin (GDP +Pi) ya hidrolize olmasinada gereksinimi vardir. Ribozomdaki (A) yerine anlamsiz bir kodon girdiginde sonlandirici faktr RF1 ise UAAyi UAGyi RF2 ise UAA ve UGA yi tanir. Ayrica Dur (Stop) kodonundan sonraki baz genellikle Adenin (A) olup etkili bir terminasyon (sonlanma iin) gereklidir. Esas olarak drt baz uzunlukda son kodon sz konusudur. Sonuda daha ileri dzeyde zincir uzatilmasi bloke edilir.

    35. Tablo 1. Eukaryotik ve prokaryotik Translasyon Arasinda Bazi Karsilastirmalar

    36. RF1 ve RF2 nin sanki t-RNA imis gibi (A) yerine baglandigina dair kanitlar vardir. Yani bunlar t-RNA yapisini taklit ettiginden taninmaktadirlar. Bu dsnce molekler mimikri grsne yol amistir. Bu dsnceye gre protein yeterli grev yapmasi iin nkleik asitlerin proteinlerle mimikrisininde sz konusu oldugu bir sre sz konusudur.

    37. Sekil 17. EF-G araciligi ile Ribozom Translokasyonu Translokasyon ncesi halde (D) ve (A) yerleri dolu (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.) Translokasyon sonrasi (E ve (P) yerleri dolu isgal edilmis hale geilir. E. Yerindeki bosalmis t-RNA disari firlatilir.

    38. Sekil 18. Ribozom zerinde Translokasyon ve peptit bag olusumu dngs :Peptit bagi transfer edildikten sonra ribozom m-RNA kodon zerinde bir nite ilerler. Simdi yeni t-RNA ile peptit (P) yerindedir. Burada (A) yeri aiktir. Bu rnekde (A) yerine hareket eder bir sonraki t-RNA glutamik asittir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    39. Sekil 19. Ribozomda zincir sonlandirma: (A) yerindeki anlamsiz kodon iki sonlandirma faktrnden biri tarafindan taninir. Bu durumda RF1 unsuru (UAG) yi tanimistir. Daha sonra komplex yapi peptiti birakarak islemi srdrr. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    40. TRANSLASYON HIZI VE ENERJI MALIYETI Daha nce bahsedildigi gibi protein sentezinin ortalama hizi prokaryotlarda saniyede (15) peptit bagidir.Baslatma ve sonlandirma zamanin hari tutarak ortalama (300) amino asitlik bir protein yaklasik (20) saniyede sentezlenir. Serbest birakilan protein nihai yapisina kendiliginden yada bazi diger proteinler yardimiyla kavusur. Buna esit bir Eukaryotik protein ise (2,5) dakikada sentezlenir. Enerji maliyeti ise her peptit bagi iin drt yksek enerjili fosfat bagidir. Bunlarin ikisi t-RNA yklemek iin ATPden ikiside t-RNA nin (A) yerine baglanmasi ve translokasyon iin (GTP) hidrolizinden saglanir. Genel olarak her protein iin 1200 yksek enerji bagi gerekir. Bu maliyet olduka yksek olup E.Coli hcresinin enerji retiminin yaklasik % 90i protein sentezine gider. Bu yksek enerji maliyeti muhtemelen canli sistemlerin protein sentezinin isabeti ve hizi iin demeleri gereken maliyettir.

    41. Transkripsiyon ve Translasyonun Eslesmesi E.Coli gibi ekirdek yapisi olmayan prokaryotlarda translasyon transkripsiyon tamamlanmadan nce baslar. RNA polimeraz transcribe edilen gen (DNA) si zerinde yer alirken m-RNA sentezlenir. Bu maksatla m-RNAya dzinelerce ribozom eklenir. Translasyon m-RNAnin ilk defa sentezlenen besinci ucunda (5) basladigindan nce baslatma faktrleri olusur. Transkripsiyonun baslamasindan hemen sonra translasyon baslayacaktir Translasyon m-RNAda ilerledike bunun besinci ucu (5) sekillenmis olan yeni bir baslatma kompleksine maruz kalir. esitli birden ok ribozomun ayni m-RNAyi transfer etmek zere birlikteligi poliribozum (yada polizom) olarak adlandirilir. Prokaryotlarda m-RNAlarin ogu esitli(birden ok gen icin) genler iin bilgiler ierir. Bunlarin RNAlarini polysistronik oldugu sylenir. Sistron geni ifade eder baska bir terindir. m-RNA zerindeki her gen bagimsiz olarak transle edilir. Herbiri ribozomun tanimasi iin Shine-Delgaino dizilimine ve (fMet) iin (AUG) baslatma kodonu sahipdir. Ilk genin translasyonu tamamlayan ribozomun ayrilmadan nce ikinci gene gitmesi yada girmemesi sz konusu olabilir. Herhangi bir genin translasyonu burada belirtilen safalari gerektirir. Eukaryotlarda ise hemen hemen tm mRNA lar sadece bir gen ierir (Monosistronik).Bu durumda her gen icin ayri ayri mRNA olusturulur

    42. Sekil 20. Polizomda protein sentezi: Meydana gelen proteinler 50(S) alt nitedeki bir tnelden ikarlar. DNA transkribe edilirken bir yandan mRNA ribozomlarida transle edilir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    43. Sekil 21. Polisistronik prokaryotik mRNA: Ribozom ilismesi iin Shine-Delgarne dizilimi ile her geni belirleyen baslatma ve sonlandirma kodonlari. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    44. RIBOZOM ZERINDEKI FONKSIYONEL YAPI YERLERI Ribozomal alt nitelerin sekli ve bilesimi hemen hemen bilinmektedir. Ayrica tm protein ve (RNA) unsurlarida izole edilmistir. Islemlere iliskin yol bilinmektedir. Ancak ribozom zerindeki translasyonda cereyan eden islemlerin stero kimyasi hakkinda bazi ilave bilgiler gerekmektedir. Halen ribozomun bazi kisimlarinin zellesmis grevlerini bilmekteyiz. Mesela m-RNA baslatma faktr, Ef-Tu, gibi unsurlar Translasyonda (30(S) lik ribozom kismi zerinde aktivite gsterdigi bilinmektedir. Bu 50(S) lik kisim yapi boyunca onu kateden bir tnele ynelmis yariga sahiptir. Bu kisimda membran baglama yerine yakindir.Tnel yaklasik 40 aminoasit boyundaki peptid uzunlugunu alir. Her ribozom membrani baglama yerine sahip olmasina ragmen btn aktif ribozomlarin hepsi membranlarla sinirli onunla irtibatli degildir.

    45. Sekil 22. Prokaryotik ribozomlar zerindeki fonksiyonel yerler. Ribozom membran geidini kapsayan bir protein sentezlemektedir. mRNAnin 30Slik alt nite, yarik, tnel ve 50Slik nitenin membran baglama yerine gre pozisyonuna dikkat ediniz. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    46. PROTEIN YNLERDIME VE SINYAL HIPOTEZI Proimal edilen proteinlerin hcre iinde bulunmalari gereken yerel gnderilmelerine iliskin mekanizmalarda protein hedeflemesi denir. Ribozomlar ya sitoplazmada serbest olarak yada membran ile birlikte ona bagli dururlar.Eu karyotlarda ribozomlar Endoplazmik Reticulum(ER) adli zarlar memranlar sistemi icinde yer alir.Sentez surecinde Hangi ribozomun seilecegi sentezlenen protein tipine baglidir.Membrana bagli ribozomlar membrana giren proteinleri reten serbest ribozomlardan ayirtedilemezler.eu karyotlardaki cesitli yapilar yeni sentezlenen proteinlerin ribozomdan direk olarak ER kanallarina salinmasini saglar. Bilindigi gibi proteinler ribozomlarda uretildikten sonraTRANSLASYON SONRASI MODIFIKASYONLAR ADLI BIR SERI ISLEMLERE MARUZ KALIR. Bu islamler N yada C ucundaki aa larin uzaklastirilmasi yada modifikasyonu, bazi karbohidrat yan zincirlari ekleme, zincirde kirpma yapmak, bazi metallerle komplex yapmak, bazi aa larda modifiksayonlardir. Polipeptidlerin daha sonra gitmesi saglarmaktadir. Bu konuda sinyal hipotezi nerimektedir. Daha sonra hedef yere gidildikten sonra buraya gitmesini saglayan SINYAL dizi enzimatik olarak uzaklastimaktir.

    47. Sinyal peptit proteinden sinyal peptidaze adi verilen enzim yardimiyla ayrilir. Rekombinant DNA teknigine iliskin alismalar bu hipoteze iliskin nemli destekleyici bulgular saglamistir. Bazi farkli proteinler farkli membrana bagli blmelere (mesela golgi cihazi) girdigi iin meydana gelen proteini uygun mebrana ynelten mekanizmalarin olmasi gerekir. Bu zgnlk sinyal dizilim reseptr (signal sequence receptors) adi verilen membran bagli glikoproteinlere ve tam sinyal dizilimine baglidir. Ribozom havuzlara proteinlerine baglaninca sinyal peptitin sinyal dizilimi reseptr ile etkilesimde bulundugu ve varsayimsal olarak proteinin membran iin zgn olup olmadigini belirlenildigi dsnlmektedir. Eger yle olursa geri kalan sre devam eder. Eger yle degilse ribozom membrandan birakilir. Sinyal peptitlerin transkripsiyon ya da translasyon tanima kutulari gibi ortak (consensuz) dizilimler iermesi gerekmedigi grlmektedir.

    48. Tablo 2. Sigir Prolactin Proteini iin Sinyal Peptit NH2-Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser? Thr Pro Val......... Asn Asn Cys-COOH

    49. Burada orta satirin sonundaki dsey izgi sinyal peptiti (199) kkden ibaret geri kalan proteinden ayirir. Mitokondria larin maruz kaldigi zel durumlarda hem ite ve distaki membranlardan bin civarinda protein geirilmesi gerekmektedir. Yakin zamandaki arastirmalar dis membranda bir translokasyon proteinler ailesinin varligini gstermistir. Bunlara tom proteinleri denir. Ayni sekilde i membranda da farkli bir translokasyon proteinleri seti (tim proteinleri adi verilir) nin varoldugu bunlarin sitoplazmadan mitokondriya ya dogru sentezlenen proteinlerin geisini kontrol ettigi anlasilmistir.

    50. Sekil 23. Sinyal Hipotezi: Sinyal peptit, SRP tarafindan taninir. Bu islem sonucu olarak Ribozom, Havuzlama (Dockina) proteinlerine yada memran daki (SRP) almacina ekilir. Sentezlenen peptil memran kanalindan geirilir. Membranin diger yanindaki sinyal peptit aze enzimi (SP) isi biten sinyal peptidi uzaklastirir. Gecirim bitince Ribozom serbest kalir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    51. PROTEIN MOLEKLLERININ KATLANMASI 1972 Nobel dl sahibi Biyokimyaci Christian Anfinsenden beri ribonkleaz enziminin in vitro deneturasyondan sonra yeniden katlandigi bilinmektedir. Proteinlerin nihai yapilarina kavusmalarinin (ekirdek ve tertiar yapi) kendiliginden olduguna inanilmaktadir. Ancak yakin zamanlarda bazi proteinlerin normal olarak kendi nihai aktif kesitlerin bazi refakati, dadi (chaperon) ya da molekl refakatilari (chaperon) adi verilen olusumlarin yardimi olmaksizin yapamadiklari anlasilmistir. Bu terim ilk kez R.A Casley ve arkadaslarinca nkleoplazmin proteinin aiklamak iin kullanilmistir. Bu protein histonlardan nkleosom olusumunu saglar. Bu terim ilk kez J.Ellis tarafindan daha genel olarak diger proteinlerinde katlanmasini yardimci olan protein anlamina kullanilmistir. Molekler chaperonlar proteinlerin katlanmasi iin uygun bir boyutlu yapiya sahip grnmemelerine ragmen bu isleme yardimci olurlar. Ancak daha ziyade chaperonlarin kodlamanin erken dneminde proteine baglandigi anlasilmaktadir. Ellis isimli arastiriciya gre insanlardaki gibi bunlar yanlis etkilesimlerden korunmaktadir.

    52. Sekil 24. E.Coli de cheperon ve ilgili proteinlerce kontrol edilen protein katlama modeli: Meydana gelen iplak protein ribozomlardan iktika (DnaJ), (DnaK) bir araya gelir, (GrpE) unsur biraraya gelir ve (DnaJ) (DnaaK) proteinlerinin ADPyi serbest birakmasina ve (ATP) ye baglanmasina yol aar. Neticede proteinler (GroEL) ve (GroES) varillerine transfer edilir. esitli (ATP) hidroliz asamalarindan sonra protein kontrol katlanmaya maruz kalir. Bu esnada (GroES) yapisi (GroEL) ulari arasinda tekrar dng saglar. Neticede katlanmis protein serbest (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    53. GENETIK SIFRE (KOD) 1950 ortalarindaki arastiricilar genetik kodun belli bir amino asidi belirleyen nkleotid diziliminden ibaret olarak dsnyorlardi. Bu dnem arastiricilari kod st ste akisiyormu. Kod kelimeleri arasinda nkleotitler (araliklar kesiklikler) varmi? Kod kelimesi kodon ka harflik olunca anlam tasir? Gibi sorulara cevap aramistir. Yapilan esitli deneyler ile bu sonulara cevap bulunmus. SIFRENIN L NITELIGI esitli kanitlar sifrenin niteliginin l oldugunu gstermektedir. Yani (mRNA) daki ardisik baz bir aminoasidi belirler. Eger kodonlar sadece bir baz ierseydi sadece drtbaz oldugundan ancak (4) aminoasidin belirlenmesi szkonusu olabilirdi. Sadece (4) esit baz oldugu dsnlrse ikili kod halinde ancak 4x4=16 adet iki baz iererek katina (kodon) sz konusu olabilirdi. Oysa en azindan 20 kelime (kodona) ihtiya vardir. l kod halinde ise 4x4x4=64 adet baz ieren kelime (kodon) sz konusu olabilir. Bu sayida (20) den fazladir.

    54. KODUN L NITELIGINE ILISKIN KANITLAR l kod kavrami zellikle Francis Crick ve arkadaslarinin mutant genlerle yaptigi dahiyane deneysel islemlerle glenmistir. Bu denemelerinde acridin boyasi proflavin gibi kimyasal mutajenler kullanilarak (T4) bakteriofajinda hizli lisis le ilgili (rIIB=RII lokusu nun B sistronu)) inaktivasyonu saglanmistir. Proflavin; gen (DNA)i ya nkleotit katarak yada ondan nkleotit kopararak inaktive eder(mutant formunu olusturur). RII geni E.Coli hcrelerinde byyen bakterofajin plaka morfolojisini belirler. Bu genin iki sistronundan biri B dir.Byle mutantlar E.colinin B susunu kolayca infekte eder ama K12 susunu edemez . Hizli lisis mutantlari byk plaka olustururken (rII+) orijinal gen tipi normal plaka morfolojisi olusturur.

    55. KOD (SIFREDEKI) AKISMALAR VE NOKTALAMALAR Kodun noktalama isaretleri (nokta, virgl vs.) olup olmadigi st ste akisip ekismedigi sorusu zerine yapilan alismalar genel olarak noktalama olmayan st ste akismayan sifre grsnn kabulne yol amistir. Noktalama isaretleri konusu kod kelimelerinin ( harfli kelimelerin) ardarda birbirine bitisik aralik birakmadanmi yazilip yazilmadigini ifade eder. Mesala (GTACA) dizilim eger okunmada cakisma sozkonusu ise ilk nukleodit (GTA) birinci mumkn okuma, akisma ile olusan ortadaki (TAC) ikinci okuma ve gene akisma ile olusan son l (ACA) dir. Byleca bunlar (aa1,aa2,aa3) gibi amina asidi kodlar.EGER BU DURUM BOYLE ISE ortadaki lnn kodladigi aanin iki yaninda sadece belli aa ler yer alabilir

    56. Sekil 25. DNAda bir yada ok sayida nkleotitlerin ( adet olmayacak dzeyde) delesyonu (eksilme) yada addisyonu (ekleme)sinde ileri gelebilecek ereve kaymasi mutasyonlari :Gsterilen normal mRNA (CAG) tekrarlarina sahiptir. Bir nkleotidlik eksilme okuma erevesini degistirir ve (AGC) tekrarlarindan ibaret okuma elde edilir. Daha sonraki bir araya ekleme okunma erevesini dzeltir. Bu sekillerdeki yildizlar delesyon (eksilme) yada eklenme (addition) yerlerini belirtir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    57. Sekil 26. (CAG) tekrarlarinin kodlama erevesi nce degisir sonra ekleme (araya koyma) ile dzelir. Yildiz isareti araya aklemeyi gsterir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    58. Sekil 27. Genetik kod akismayan ve noktalama isaretleri olmayan bir biimdedir (stte) bu olgu kanitlanmadan nce kodun bir iki baz st ste akisabildigi (ortada) ve kod kelimeleri arasinda kodlamayan bazlar bulundurularak noktalama isaretlerinin konuldugu (altta) dsnlyordur. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    59. KODUN (SIFRENIN) ZLMESI akismayan triplet sifre kavramina gre (64) Altmisdrt kodonun ne anlama geldiginin belirlenmesi gerekir. Szgelimi (ACU) hangi aminoasidi belirliyor. Bu alismalar iki safali yrtlmstr. Ilk safada MW.Nirenberg ve S.Ocha ve arkadaslari uzun suni (mRNA) lar yapmis ve hangi aminoasitlerin bu (mRNA) sayesinde proteinlerde bir araya geldigini belirlemislerdir. Ikinci safada zel l RNA dizilimleri sentezlenmistir. Her dizilime baglanan aminoasit tRNA komplexleri belirlenerek sifre zlmstr. SENTETIK mRNAlar Polinkleotit fosforilaze enziminin uzun zincirli (mRNA) sentezleme yetenegi ilk kez M.Grunberg, Manago ve Ochaa tarafindan (1955) de kesfedilmistir. Bu enzim difosfat nkleositleri uzun zincirli tek kollu nkleotitler haline koyar. Normalde grevi RNA yikimidir.Ancak ribonkleosit difosfat derisimi yogun oldugu in vitro ortamlarda RNA imal eder Polimeraz enziminin aksine polinkleotit fosforilaze enzimi etki yapacagi bir primere (ncye) ,DNA kalibina ihtiya duymaz. Bu enzim btn bakterilerde bulunur ve muhtemelen hcredeki asil grevi kullaniminin tersi (RNA yi imal degil de paralama)islevi saglamaktir.

    60. Bu metoda Hcresis sistemlerde karisik kopolimerler le yapilan deneylerde sentezlenen proteinde yer alan herhangi bir amino asididin yzdesi hesaplanarak bu yzdeye karsilik gelen triplet kompozisyonu tahmin edilmektedir. Buna gre elde edilen proteinde bulunan belli bir esit amino asit yzdesi yukaridaki tabloda verilen olasiliklarda hangi yada hangilerinin toplamina denk geliyorsa ilgili amino asidi ilgili sifrelerin kodladigi varsayilir. Mesela herhangi bir amino asid %69ise yukaridaki olasiliklardan (0,58) ile (0,12)nin toplami yaklasik %70 bure denk geliyorsa bu seeneklere iliskin sifreler bu (aa) lar kodlari sonucuna varilir. Kuskusuz tek esit (aa) meydana gelemeyecektir. Diger amino asidlerin yzdeleride belirlenerek bunlara denk gelen l sifre olasiliklarina gre hangi sifrelerin (yada sifrelerinin) hangi amino aside denk dstg belirlenir. Ancak belli bir sirayi belirlemek mmknsede belli diger bazi sirayi belirlemek mmkn degildir. Mesela sistein Losin ve valin hepsi iki (U) ve bir (G) ieren koda sahiptir. Yani bu deney iki(U) bir (G) ieren bu bazlarin diziliminin (5-UUG-3) yada (5-UGU-3) veya (5-GUU-3) dizilim sirasinda olup olmadigini belirlemez. Bu konunun cevabi trinkleotitler olarak bilinen unsurlarin sentezi ile anlasilabilmistir.

    61. Tablo 3. Sansa bagli bir araya getirilen (5U:1G) oranindaki urasil guanin ieren ribodifosfonkleotitler karisimindan yapilan suni mRNA larin yapisi.

    62. SENTETIK KODONLAR Belli bir bilesimdeki trinokleotitlerin imalati mmkn oldugunda Nirenberg ve P.leder 1964de baglanma saflik testi (Binding Assay) yada TRIPLET BAGLAMA DENEYI denen olguyu gelistirdiler. Arastiricilar izole edilmis E.Coli ribozomlarinin yksek molaritede magnesyum klorit varligi halinde bunlar sanki (mRNA) imis gibi trinkleotidlere baglandigini gstermistir. Bu durumda ribozomla birlikte olan l RNA tripletinin (trinkleotidi) sayet ortam da varsa btnler antidokonu tasiyani tRNA ya da baglama sz konusudur. Bylece radyoaktif aminoasitleri kullanarak hangi mRNA trinkleotidinin hangi amino asidi kodladigini belirlemek mmkn olur. Belli bir bilinen baz dizilisine sahip verilen sentetik trinkleotid i ieren ribozomlar dan olusan karisim ile radyoaktivite ile isaretlenen denenecek aa yklenmis tRNA bir araya getirilir .Yani Aminoasit t-RNA lar ile RNA li ribozom karistirilir, reaksiyon karisimi bir nitro seluloz filtreden geirilir.Burada Ribozomlar byk oldugundan bu filtreden gecemezken ykl tRNA gibi kk molekuller gecer.Ama eger ykl tRNA ribozama baglanmissa gene geemez. Eger radyoaktif filtreden geerse bu durum radyoaktif amino asidi tasiyan tRNAnin tripleti tasiyan ribozoma baglanmadigini gsterir.Yani denenen aa yanlistir bu aa nin kodonu denenen triplet degildir sonucuna varilir Bu deney diger bir isaretlenmis amino asitle tekrarlanir.

    63. Yani bu yntemde szgelimi (GCC) tripleti kullanildiginda ribozomla birlikte (alanin tRNA) filtrelere tutundugundan GCCnin alanin sifreledigi anlasilir. Bylece filtrede radyoaktivite gzlenirse arastirici ilgili aminoasidin ribozoma tutuldugunu anlar. Bylece bu aminoasidin ilgili trinkleotit kodon tarafindan belirlendigi anlasilir. Diger bir deyimle antikodonu sentetik trinkleotid kodonuna btnler olan transfer RNA ya eklenmis radyoaktif aminoasit ribozoma bagli olmasi prensibinden yararlanilir. Sekil 31de grldg gibi (5-CUG-3) trinkleotidi ele alalim. (3-CAC-5) antikodonunda tRNA yapisi losin ile yklensin karisim filtreden geirilsin. losin hari treonin ya da herhangi bir aminoasit radyoaktif ise radyoaktivite filtreden geecektir. Deneme radyoaktif losinle tekrarlanirsa losin daha dogrusu radyoaktivite filtreden geemeyip orda kalacaktir. Kisa bir zaman zarfinda tm kodonlarin bu sekilde sifreleri zlmstr Daha sonralari TEKRARLAYAN KOPOLIMER deneyleri ile sifre konusu tamamiyle aydinlanmistir.Bu usulde Khorana iinde kisa dizilerin surekli tekrarlandigi uzun RNA molekulleri olusturmus bunlarin hucresiz ortamda Yollatiklari aa dizileri( polipeptid=protein)karsiliklari incelenmistir.Bu durumda tekrarlanan dinukleotid tekrarlanan iki tripletli mesaja Tekrarlanan tri nukleotid ise okuma cercevesine gore tekrarlayan tripletli mesaja ve nihayet tekrarlayantetranukleotid ise Tekrarlayan dort tripletli mesaja dnsr.Elde edilen polipeptitlerin aa ierigine gore sonuclar yorumlanir.

    64. Tablo:4 l baglama degerlerinde elde edilen l nkleotidlere zg amino asitler.

    65. Sekil 28. Baglanma saflik testi (Binding assay) yntemi aminoasitlere eslik eden dizilim bilinen bir trinkleotid kodonu belirlemeye yarar. Btnler olmayan kodon dizilimindeki (t-RNA) lar membran boyunca geerler. Ribozoma bagli antikodonu trinkleotide btnler (t-RNA) li olusumlar ise filtreden geemez. (t-RNA) eger radyoaktif aminoasitle yklenirse radyoaktivite filtreden geemez orada kalir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    66. Tablo 5. Genetik sifre tablosu Her gzn ustndeki yildiz(carpi; x; *) sayisi sirasiyla 1, 2, 3yildiz iin ilk iki baza gre nc baz ne olursa olsun Tekesit (aa) e, iki esit (aa) e ve Dur, tek, iki esit (aa) leneticelenen sifreyi belirtir.

    67. Sekil 28a: Genetik sifreleme szlg. Aug, polipeptit zincirlerininogunun sentezini baslatan metionini belirler. UGG ile sifrelenen triptofan disindaki diger btn amino asitler 2 ila 6 tane l tarafindan belirlenir. UAA, UAG ve UGA lleri sonlanma sinyalleridir ve hibir aminoasiti belirlemezler. (William S. Klug, Prof Dr. Cihan ner. Genetik Kavramlar, Palme Yayincilik, 2003ten modifiye edilerek alinmistir.)

    68. WOOBBLE HIPOTEZI Genetik kodun bozulmus (Dejenere) bir kod (sifre) oldugu ifade edilmektedir. Bu olgu bir aminoasidin birden ok sifre ile ifade edilmesini tanimlar. Yani mkemmel bir sifrede bir kod (sifre) un yanlizca bir anlami olmalidir. Byle olmadigina gre o zaman bu sifre bozulmus sifredir diye dsnlmektedir. Tablo 4de gsterildigi gibi (16) gzden sekizi herbiri sadece bir ve ikinci pozisyonu dikkate alinarak olusturulan sira stun kesisimi yerindeki her gzde bir aminoasit bulunur. Sz gelimi (UUX) gz gsteriminde (X) sembol drt bazdan herhangibiri olabilir anlamindadir. Yani ilkiki baza gre (8)sifre sadece bir (aa) ete kabul eder. Bylece bu (8) aminoasit de kodon sadece ilk iki pozisyondan okunabilir. nk kodonun nc bazi ne olursa olsun ayni amino asit temsil edilmektedir. Bu sekiz kodon grubuna karismamis kodon familyasi (toplulugu) adi verilir (unmixed families) karismamis kodon familyasi ayni iki bazla baslayan drt kodondan biri ile sonlanan bir amino asidi kodlayan dizilimdir. Mesela (GUX) kodonu valini kodlar.

    69. Karismis kodon familyasi (mixed families) ise ya iki ayri esit aminoasidi kodlayan 6 gz ve bir dur ile bir yada iki aminoasidi kodlayan iki gz olmak uzere 8 gzden olusur. Alti esit ilk iki baza gre iki esit (aa) e tekabul eden sifreleri ieren karismis Aile(familya) gz yada kutusu iki yarima blnrse kodonlarin nc bazda purin ya da purimidin farkliligina gre farklilastigi grlecektir. Mesela (CAU) ve (CAC) her ikiside histidini kodlar her ikisinde de nc baz urasil (U) ya da sitosin (C ) purimidin bazidir. Sadece bu iki kodon ailesi farkli biimde ayrilirlar. Bu nc pozisyonun genetik sifrede nisbeten az nemli olmasi hususu muhtemelen (tRNA) ya iliskin iki zellikden ileri gelir. Birinci husus E. Colide (aa) leri kodlayan (64) ssifredeb dur sifresi oldugundan bunlar ikarilirsa 61 sifre olduguna gre birden baslatma sifresi dsnlrse (62) t-RNA olmasi gerekmesine karsilik sadece (50) farkli ((tRNA) vardir.

    70. Sekil 29. Kodon ve antikodonlarin baz pozisyonlari besinci udan (5) itibaren numaralanir. Kodondaki nc pozisyon (3) antikodonda (1) pozisyona tekabl etmekte olup sallantili (wooble) baz olarak adlandirilir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    71. Tablo 5. nc kodonun pozisyonundaki eslesme kombinasyonlari

    72. Aminoasitleri belirleyen (61) kodon oldugundan baslatma gibi islemler iin ilave kodonlara ihtiya duyulmaktadir. Ancak E.Colide gerekte (50) farkli t-RNA vardir. Ikinci nemli husus inosin gibi nadir bazlar antikodonda bazen belirebilir. Bu durum genellikle kodonun nc pozisyonuna btnler kisima karsilik grlr. Bu iki husus (t-RNA) da nadir bazlarida ieren bir esit (t-RNA) koruma sreci kavramina yol amistir. Karisikligi nlemek iin hem m-RNA ve hem de t-RNAnin bazlarinin normal olarak besinci udan itibaren numaralandigini hatirlayalim. Bylece kodondaki bir numarali baz antikodondaki numarali bazin btnleridir. Bu nedenle daha az nemli kodon bazi numarali bazdir. Oysa bunun antikodondaki btnleri bir numarali bazdir. Antikodonun ilk pozisyonu besinci u (5) her zaman diger iki pozisyon gibi sabit ve degismez olmadigindan bu pozisyondaki verilen bir baz pozisyonunda kodonun nc pozisyonundaki esitli bazlardan herhangi biri ile eslesebilir. Crick bu yetenegi sallantili(gevsek)= (wooble) terimi ile ifade etmistir. Tablo (5) bilinen kodonlara gre karsilastirmali olarak retilebilecek t-RNAlara iliskin muhtemel eslesmeleri gsterir. Mesela eger izolosin t-RNA si 3-UAI-5 antikodonuna sahip ise bu olusum bu aminoasit iin u kodonla belirlenecek bir birliktelikle olusacaktir. Bu olusumlar ise (5-AUU-3), (5-AUC-3) ve (5-AUA-3) seklindedir. Burada antikodonun besinci ucundaki (5) ilk pozisyonda inosin kodonun nc ucundaki (3) nc pozisyondaki (U), (C) veya (A) yi taniyacaktir.

    73. GENETIK SIFRENIN EVRENSELLIGI 1979 a kadar bilim adamlari genetik kodla ilgili denemelerinde genetik kodun niversal oldugu yani btn canlilarda ayni oldugu yolundaki sonular ifade etmislerdir. Yani sifre szlg E.Coli insani, mese agaci v.s tm trlerde ve zamanlarda aynidir. Kodun evrenselligin hususu mesela Tavsan retikulositlerinden m-RNA ve ribozomlar alinip bunlari E.Coli den elde edilen aminoasit t-RNA gibi diger translasyon unsurlari ile karistirarak yapilan deneylerle tanimlanmistir. Byle karisimlardan Tavsan hemoglobininin sentezlendigi gzlenmistir. (1979) ve (1980) de bu olguya bazi aykiriliklar ortaya ikmistir. zellikle yapisal proteinler iin mitokondrial genlerin dizilimleri incelendiginde byle bir durum ortaya ikmistir. Sz konusu evrensellikde iki esit sapma olmaktadir. Birincisi kodu okumak iin daha az t-RNAya ihtiya duyulmasi olgusudur. Ikinci husus mitokondrial ve hcresel sistemlerde kodonun farkli biimde anlamlar ifade ettigi esitli rnekler vardir.

    74. Yere zg varyasyon konusunda son rnek aminoasit selono sisteindir. Bu unsur slfr atomu selenyumla degismis sisteini ifade eder. Bir ok proteinler byle olagan disi amino asitlere sahiptirler. Ancak bunlar daha ziyade normal amino asitlerin translasyon sonrasi modifikasyonu ile olusur. Ancak selanosistein aminoasidi direk olarak E.Colide format dehidroganaze gibi bazi proteinlerin yapisina girer. Burada selenyum enzimin aktif yerini olusturur. tRNA sayesinde proteine girmis olan selonosistein eger bu kodon m-RNAda zel kk-lop benzeri sekonder yapida yer aliyorsa (UGA) terminasyon kodonu olarak taninir. Selanosistein t-RNA yapisi orijinalde serin ile yklenir. Ancak daha sonra modifiye olarak Selano sisteinle yklenir. Bu srede Kk-Lob benzeri yapiya ilaveten ribozom amber kodonunda UAG nc asagi yne dogru selenosistein uzatma (elangation) faktrne (selono cystein Elengation faktrne =SELD ihtiya duyulur. Bu benzer mekanizmalar eukaryotlarda da olmasi beklenir. Ancak tm bu unsurlara iliskin henz yeterli bulgu ve tanimlamalar elimizde mevcut degildir.

    75. Tablo 6. Bira Mayasi mitokondriasinda genetik kod (antikodonlar gzler iinde verilmistir (3 5) (ACU; Trp) anti kodonu tahmin ile elde edilmistir.

    76. Tablo 7. Kodonlarin Yaygin (Olagan) ve Alternatif Anlamlari

    77. Sekil 30. Kodonun nc (3) pozisyonundaki Inosine ve Guaninin baz eslesme olasiliklari Woobble pozisynundaki Guanin hem Sitozin ve hemde Urasille baz eslesmesi yapabilir Wobble pozisyondaki Inosin Sitozin, Adenin ve Urasille eslesebilir. (Robert H. Tamarinin Principles of Genetics (Sixth Edition, WCB/McGraw-Hill), isimli kitabindan modifiye edilerek alinmistir.)

    78. GENETIK KODUN ZAMANLA DEGISIM SRECI Genetik kodun Wobble (Sallantili) oldugu hususundan yola ikarak Triplet kolun ilk iki bazinin milyonlarca yil nce kullanilmis az sayida aminoasitlerin varligina tekabl ettigi ifade edilmistir. Buna gre faydali zellikleri olan amino asitler ortaya iktika bunlar daha az zgnlk gstermesine ragmen nc bazin okunmasindaki degisim ile kod modifikasyonu suretiyle proteinlerin yapisina girme olanagi bulmaktadir. Altmis bir mmkn kodonun kullanilmasi biyolojik sistemlerin bir lde bazi mutasyonlara karsi korunmasina yol amaktadir. Szgelimi karismamis kodon ailesinde (5-CUX-3) deki nc pozisyondaki herhangi bir mutasyon ayni aminoasit iin diger bir kodonu olusturur. nc pozisyondaki sallantililik ve kodon dzenlemesi olgusu kodonun nc pozisyonundaki mutasyonlarin yarisindan azinin farkli aminoasit belirlenmesi ile sonulanir.

    79. Mesela ortadaki bazin (U) oldugu btn kodonlardan aminoasitler hidrofobiktir. (Leucine, Isoleucine, Metionine ve Valin). Bu kodonlarin herhangibiri iin bir yada nc pozisyondaki mutasyon hala hidrofobik aminoasitleri kodlar Aspartik asit ve glutamik asit gibi negatif ykl aminoasitlerin ikiside (GA) ile baslayan kodona sahiptir. Fenilalanin Tyrosin, Tiriptofan gibi tm aromatik aminoasitler urasille baslayan kodono sahiptir. Byle bir model mutasyonun etkisini azaltir Genetik kodon da bir kodonun diger kodona degismesi suretiyle mutasyonlarda vardir. Bunlar ayni zellikte aminoasit zellikleri ile sonulanir. Fonksiyonel proteinlerin byle mutasyonlarla olusmalari olasiligi yksektir.

More Related