动物繁殖理论与生物技术

1. 动物繁殖理论与生物技术

2. 第十三章 禽类繁殖生物技术

3. 第一节 禽类的生殖生理 • 一、 公禽的生殖器官 • （一）睾丸 • 公禽睾丸位于腹腔脊柱腹侧，由短的睾丸系膜悬吊于腹腔体，前接胸腹膈和肺，背部接肾前部。 • 睾丸由睾丸间质和睾丸实质组成。 • 公禽睾丸精细管壁由生精细胞和支持细胞组成。

4. 第一节 禽类的生殖生理 • 一、 公禽的生殖器官 • （二）附睾 • 禽类附睾是一长纺锤形的管状膨大物，位于睾丸背内侧凹缘，与睾丸一起包在被膜内，由睾丸网、睾丸输出小管、附睾小管和附睾管共同组成。 • 禽类附睾管短，向后与长而弯曲的输精管相接。禽类附睾不发达，较小，仅在睾丸活动期才明显扩大，且附睾内不贮存精子。

5. 第一节 禽类的生殖生理 • 一、 公禽的生殖器官 • （三）输精管 • 输精管左右两侧各一条，与输尿管平行，为极弯曲的白色细管，长约10cm。 • 输精管上皮能分泌酸性磷酸酶，精子最后在此成熟，其囊状部常有大量成熟精子，精子也可被输精管上皮所吸收。

6. 第一节 禽类的生殖生理 一、 公禽的生殖器官 （四）交媾器 公鸡的交媾器：公鸡没有真正的阴茎，但有一套完整的突起，称交媾器，位于泄殖腔后端腹侧，一般情况下隐匿在泄殖腔内，由输精管乳头、脉管体、阴茎和淋巴褶四部分组成。 水禽的交媾器：水禽（鸭和鹅）的交媾器由一对输精管乳头和阴茎组成。水禽的交媾器较发达，为螺旋锥状体，其表面有螺旋形的输精沟。

7. 第一节 禽类的生殖生理 • 二、公禽的精子与精液 • （一）精子的形态特点 • 禽类的精子有一个很长的头部，头的前端有尖形的顶体，有一个短的中段连接着一个长长的尾部。 • （二）精液性状 • 禽类的精液为乳白色或略带黄色，是不透明的乳状液体，略带腥味。若混有血液，则精液呈粉红色，被粪便污染的精液则呈黄褐色。禽类的精液由精子和精清组成。禽类精液的密度大，其粘度高。 • 禽类新鲜精液一般呈弱碱性。

8. 第一节 禽类的生殖生理 二、公禽的精子与精液 （三）禽类精液的化学成分 1、禽类精子本身含酯类和糖蛋白，也含有各种酶，因此精子在无氧或有氧条件下都可分解糖类为精子提供能量，而精清则是盐类和若干氨基酸组成的水溶液。 2、精液中含有粘多糖、葡萄糖、甘油等。另外，禽类精液中谷氨酸和钾含量高，而氯化物的含量低。鸡精液中碱性磷酸酶活性较高。

9. 第一节 禽类的生殖生理 三、母禽的生殖器官 （一）卵巢 1、禽类的左侧卵巢以短的卵巢系膜韧带悬吊于腹腔背侧，前端与左肺紧接，腹侧接腺胃和脾，彼此被腹气囊隔开，背侧与左肾前部相接，向后以腹膜褶与输卵管相连。 2、卵巢实质含皮质和髓质，髓质与皮质之间为致密结缔组织性的白膜，白膜伸入皮质和髓质内，形成卵巢基质。 3、禽类卵巢的成熟卵泡完全突出于卵巢表面，成熟卵泡从内向外由卵黄膜、放射带、卵黄周膜、颗粒层和卵泡膜组成，借卵泡柄与卵巢相连。

10. 第一节 禽类的生殖生理 三、母禽的生殖器官 （一）卵巢 4、卵带:卵泡上与柄相对的中央有一条无结缔组织而且血管较少的灰白色狭带。 5、体积和外形：随年龄的增长和机能状态的发展而有很大的变化。 （二）输卵管 1、位置：前端开口于卵巢正后方，沿腹腔的左背侧壁后行，后端开口于泄殖腔。 2、主要功能:完成卵细胞的受精和完成胚胎的早期发育，是保证胚胎体外发育并形成蛋的重要器官。

11. 第一节 禽类的生殖生理 三、母禽的生殖器官 （二）输卵管 3、输卵管的长度和形态随着年龄和不同生理阶段而有差异。 4、输卵管分为漏斗部、蛋白分泌部、峡部、子宫部和阴道部五个部分。 ①漏斗部：位于卵巢正后方，是精子和卵子受精的场所，分为漏斗部本身与漏斗颈部。 ②蛋白分泌部：前端与漏斗部界限不明显，后端有明显窄环与峡部区分，其基本功能是分泌蛋白。

12. 第一节 禽类的生殖生理 三、母禽的生殖器官 （二）输卵管 ③峡部：位于蛋白分泌部和子宫之间，峡部分泌物形成蛋的内外两层蛋壳膜，并补充蛋白的水分。 ④子宫部：分泌子宫液、蛋壳、壳上的胶护膜和蛋壳色素。 ⑤阴道：开口于泄殖腔背壁左侧，子宫与阴道以括约肌为界限，阴道位于子宫与泄殖腔之间的厚壁窄管。

13. 第一节 禽类的生殖生理 四、母禽的卵泡发育、排卵与蛋的形成 （一）卵子的发生与卵泡的发育 1、卵子的发生可分为增殖期、生长期和成熟期。 2、在生长期内，卵原细胞停止增殖开始生长，称为初级卵母细胞。 3、在卵母细胞生长和发育的整个过程中，卵泡的渗透性及膜的厚度发生改变，并参与卵母细胞的形成、生长和成熟过程。

14. 第一节 禽类的生殖生理 四、母禽的卵泡发育、排卵与蛋的形成 （二）排卵 1、卵泡成熟后，在激素和神经系统的控制下，使卵泡表面无血管的“卵带区”破裂，释放出卵母细胞的过程称排卵。 2、卵巢分泌孕酮，孕酮水平达到激发垂体释放促黄体素的反应阈值,于是垂体开始释放促黄体素，该激素作用于卵泡，使卵带处的微血管消失或变色，缝痕扩大，在卵泡膜肌纤维作用下，卵带区破裂，卵子排出。

15. 第一节 禽类的生殖生理 四、母禽的卵泡发育、排卵与蛋的形成 （三）蛋的形成与产出 1、成熟卵泡在促性腺激素的作用下破裂排出卵黄进入漏斗部，鸡卵黄从排出至全部纳入漏斗部约需13分钟，此时若与精子相遇，在15～18分钟内便发生受精。 2、卵黄通过漏斗部进入输卵管的膨大部后，首先被腺体分泌的浓蛋白包围，由于输卵管的蠕动作用，使卵黄在输卵管内沿长轴做被动性的机械旋转，使这层浓蛋白扭转而形成系带和系带层浓蛋白，然后被分泌的稀蛋白包围形成内稀蛋白层，而后又形成外浓蛋白层。 3、由于膨大部的蠕动，促使卵黄进入峡部，在此处形成内外蛋壳膜，包围整个蛋白和卵黄， 4、卵黄经峡部进入子宫部，在此停留约18～20小时或更长一些时间，形成蛋壳和外稀蛋白层。

16. 第一节 禽类的生殖生理 五、禽类的胚胎发育 （一）禽类胚胎的体内发育 1、禽类的胚胎发育的营养物质并不完全由母体直接提供，而主要来源于蛋。 2、禽类胚胎的体内发育在蛋的形成过程中完成；鸡蛋产出体外时，鸡胚发育已达内外两个胚层的原肠期。 （二）禽类胚胎的体外发育 1、鸡胚体外发育的临界温度为23.9℃。 2、受精蛋获得孵化条件，胚胎继续发育，在原有两个胚层的基础上形成中胚层，之后在内、中、外三个胚层基础上形成个体所有的组织和器官。

17. 第二节 禽类的人工授精 一、采精方法 （一）截取法 母禽是公禽天然的性刺激，以此为原理而采得精液的方法称截取法，据有无假阴道又可分为台禽法和假阴道法。 （二）电刺激法 电刺激法用弱电流刺激公禽射精，可用于鸡、鸭、鹅和火鸡等公禽，生产中主要用于番鸭精液的采集，也常用此法选择采精能力强的鸡、鸭、鹅等种禽。

18. 第二节 禽类的人工授精 一、采精方法 （三）按摩法 1、按摩采精法分为背部按摩、腹部按摩和背腹式按摩三种方式。 2、背腹式按摩采精法多用于体型较大、重型品种的鸭与鹅的采精，有时也用于公鸡采精的调教期，而鸡与体型小的鸭和鹅的采精，多用背式按摩采精。

19. 第二节 禽类的人工授精 二、精液品质评定 1、精液的外观正常禽类精液为乳白色或略呈黄色，乳状稠度，不透明液体。 2、采精量用有刻度的集精杯上直接读出。鸡的采精量一般平均为0.2～0.5ml。 3、精子活力 禽类精液中直线运动的精子才有受精能力，而呈圆周运动或摆动的精子则无受精能力。 4、精子密度是每毫升精液中所含的精子总数，直接影响蛋的受精率。鸡的精子密度一般为20～50亿/ml。原精液目测法估计精子活力时，一般分为密、中等和稀三个等级。 5、精子畸形率 畸形率越高，受精率越低，亦是精液品质的重要指标之一 6、PH值 禽类新鲜精液呈弱碱性。

20. 第二节 禽类的人工授精 三、精液的保存 （一）精液的液态保存 1、常温保存新鲜精液常用隔水降温，在18～20℃保存1小时用于输精，使用简单的稀释液，如生理盐水或复方生理盐水，稀释比例为1：1或１:２。 2、低温保存 低温保存时，将经稀释的精液置于30℃水浴，再放入2～5℃冰箱，在1～2小时内完成降温过程。

21. 第二节 禽类的人工授精 三、精液的保存 （二）精液的冷冻保存 （1）采精：冷冻用精液无粪便和透明液污染。 （2）稀释：采精后尽快稀释，在精液中按比例加入稀释液，稀释倍数视精子密度而定，但须确保阴道输精时输精量不超过0.4 ml。 （3）降温：在5℃条件下放置2～4小时，使精液温度由30℃以上降至5℃。 （4）加防冻剂：一般添加量甘油为3～10%，二甲基亚砜为4～6%、乙烯二醇为4～10%。

22. 第二节 禽类的人工授精 三、精液的保存 （二）精液的冷冻保存 （5）平衡：加入防冻剂后在5℃平衡15分钟至2小时。 （6）分装冷冻：每分钟降温1℃至-20～-30℃，然后以每分钟降温50℃降温至-150℃，再投入液氮保存。 （7）解冻：在0～5℃缓慢解冻或30～40℃快速解冻。 （8）输精：在子宫部或膨大部输精，若阴道部输精则输精深度2～4cm，且输精时有效精子含量为7～10亿。

23. 第二节 禽类的人工授精 四、母禽的输精 禽类的输精是用一定的器具将精液注入母禽生殖道一定部位的技术 。 （一）输精方法 1、阴道部输精 2、子宫内输精 3、膨大部输精 （二）输精时间 鸡和火鸡的输精在产完蛋的下午4点钟以后进行。鸭在夜间产蛋，输精宜在上午10点以后进行。鹅在上午产蛋，输精可在白天12点以后进行。

24. 第二节 禽类的人工授精 四、母禽的输精 （三）输精间隔和输精量 生产实践中，鸡每次输精时含原精液0.025～0.05ml，其中有效精子数为0.5～1亿，在盛产期，输入原精液0.025ml，输精间隔5～7天，产蛋中后期输入原精液0.05ml，输精间隔4～5天。 （四）输精注意事项 1、在半小时内输精； 2、若着力于右侧，则易引起母禽排粪 ； 3、斜插则不易输入精液且易损伤输卵管；

25. 第二节 禽类的人工授精 四、母禽的输精 （四）输精注意事项 4、放松对母禽腹部压力，以免精液逆流出输卵管，使精液全部输入； 5、插入输精管不要用力过大，以免惊吓、损伤母禽和造成输卵管损伤； 6、将输精管偏向一侧缓缓插入； 7、不输入空气或气泡； 8、遵守无菌操作，防止相互感染。

26. 第三节 禽类繁殖生物技术 一、禽类的性别控制 （一）鸡的性别决定 1、性染色体决定学说 性别由性染色体决定，即个体的性别取决于受精时雌雄配子所携带的性染色体的类型。把雌性异型性染色体称为ZW型，雄性为ZZ型。 2、常染色体平衡学说 生物的性别是受细胞核内染色体上雄性化基因系统与雌性化基因系统的平衡决定的，哪一类基因系统占优势就会影响胚胎性别的发育。

27. 第三节 禽类繁殖生物技术 一、禽类的性别控制 （一）鸡的性别决定 3、TDF学说 哺乳动物雄性是由位于Y染色体上的一种称之为睾丸决定因子（TDF）的基因所编码的组织相容性抗原H-Y所决定的。 4、其它基因学说SF1、SOX9、AMH 等，且它们可能在性别决定的不同层次上发挥着不同的作用，但由于它们都不是性连锁基因，一定程度上决定了它们不可能在性别决定中起决定作用。

28. 第三节 禽类繁殖生物技术 一、禽类的性别控制 （二）鸡的性别分化 1、性别的分化就是由遗传性别发育成表型性别的过程。 2、一般认为引起哺乳动物性别分化的机制是雄性特异的Y染色体Sry的表达。 3、 Lillve提出了胚胎分化的激素学说; Witsch等人提出了性腺分化的诱导学说。 4、性别分化是以性别决定机制为基础，由激素类物质诱导发生。

29. 第三节 禽类繁殖生物技术 一、禽类的性别控制 （三）性别鉴定 1、一般形态性别鉴别方法 哺乳动物最早的性别鉴定是对供体精子染色体的鉴别。 2、细胞水平上的性别鉴定 用碘化丙锭对雌性和雄性细胞核进行染色，再用流式细胞仪进行检测。 3、分子水平上的性别鉴定 利用性连锁DNA序列进行家禽性别鉴定。 ①通过DNA印迹杂交该方法是通过对鸡W染色体上XhoI家族的重复序列进行克隆和测序，用生物素标记的0.7kb重复片段的重组质粒为探针，利用杂交技术对鸡进行了性别鉴定，缺点是需要对DNA纯化。

30. 第三节 禽类繁殖生物技术 一、禽类的性别控制 （三）性别鉴定 3、分子水平上的性别鉴定 ②细胞原位杂交（ISH）利用原位杂交技术检测核苷酸序列较方便，无论是用提纯的DNA，还是细胞，甚至血液进行原位杂交，雌性和雄性都能清楚地鉴定。 ③聚合酶链式反应(PCR)鉴定W染色体，PCR技术鉴定5～7天鸡胚性别的方法。 （四）鸡的性别反转 人工诱导鸡性别反转的方法 （1）外源激素诱导：用雌激素或雄激素处理禽胚，调节皮质部与髓质部的发育，从而控制性别。

31. 第三节 禽类繁殖生物技术 一、禽类的性别控制 （四）鸡的性别反转 人工诱导鸡性别反转的方法 （2）免疫学方法诱导：用睾丸和卵巢制成的抗血清处理性别未分化的鸡胚，可以诱导性反转。 （3）芳香化酶抑制剂诱导：芳香化酶抑制剂抑制雌激素生成，睾酮浓度相对增加，使胚胎向雄性转化。

32. 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （一）禽类的体外受精和胚胎移植 1、体外受精 ①母鸡在产蛋后15分钟或20分钟回收排出的卵子，收集的卵子放在含有60～70ml改良的Ringer’s液中，取0.2～0.5ml稀释的精液，放在胚珠上，并在410C的条件下培养15分钟，使其体外受精，之后，在Ringer’s溶液中漂洗以除去精子。 ②将母鸡输卵管喇叭口拉出，撑开，体外受精的卵从烧杯灌入张开的喇叭口，使卵移向输卵管膨大部前部，放回卵巢囊中，缝合切口。

33. 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （一）禽类的体外受精和胚胎移植 2、胚胎移植 Tanaka(1994)移植了76个体外受精获得的受精卵产出53个正常蛋，31枚受精，孵出6只雏鸡。 （二）禽类早期胚胎体外培养 1、人造材料蛋壳培养体系 人造材料蛋壳培养是一种完全脱离天然蛋壳，采用人造材料容器等进行的鸡或鹌鹑胚胎体外培养方法。

34. 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （二）禽类早期胚胎体外培养 2、代用蛋壳体系我国禽类胚胎体外培养技术: ①胚胎发生阶段的鸡胚：从囊胚到孵化72小时（鸡）或到60小时（鹌鹑），直接把新生鸡胚在常规下孵化72小时，或以切去锐端的普通蛋壳作为代用壳,整个卵黄移入其中,注满培养液,无毒薄膜密封,纵轴水平方向固定,继续孵化。 ②72小时到出雏：取切去钝端的双黄蛋壳作为代用壳,胚胎移入后注入单纯稀蛋白至蛋壳切口下一定位置,无毒薄膜封口,继续孵化。

35. 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （二）禽类早期胚胎体外培养 3、三期培养体系 ①Ferry（1988）首先建立了受精卵－囊胚的体外培养方法：将卵裂前受精卵（连带卵黄和部分浓蛋白）胚盘向上置于60ml的玻璃杯中，注入培养液至胚盘水平位置，无毒薄膜密封杯口，41～42℃培养24h。 ②Ono（1994）改用20ml塑料杯，以单纯稀蛋白为培养液，41.5 ℃培养24h。

36. 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （三） 禽类嵌合体技术 1、禽类嵌合体制作方法 ①囊胚细胞分离； ②注射卵进行孵化； ③蛋的内容物转移入大一点的蛋壳中，重新封口。 2、禽类嵌合体制作分类 （1）胚盘细胞嵌合体：1970年，Marzullo 将白莱航鸡的胚盘细胞注入到横斑洛克鸡的胚盘内，从孵化后期死亡的雏鸡羽色来看，得到了嵌合胚胎。

37. 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （三） 禽类嵌合体技术 2、禽类嵌合体制作分类 （2）原始生殖细胞(PGCs)嵌合体：1976年，Reynaud切下公鸡生殖嵴部位制成细胞悬浮液，注射到紫外线照射过的鸡胚血管里，发现公鸡PGSS随血流移动到鸡生殖腺中生存， Tajima通过移植从鸡胚血液中分离纯化的PGCs成功获得了白莱航鸡和洛岛红鸡的性系嵌合体。 （3）种间嵌合体：Hajji等将鹌鹑生殖嵴部位的PGCs，注射到鸡胚血管里，性分化后在鸡的生殖腺中发现了鹌鹑的PGCs，并获得了供体后代。

38. 第三节 禽类繁殖生物技术 二、禽类的胚胎操作 （三） 禽类嵌合体技术 3、禽类嵌合体鉴定 注射鹌鹑囊胚细胞的鸡胚组织在孵化12小时后进行观察。组织固定在Zenker’s液中，切片厚度为6μm，Feulgen-Rossenbeck's染色，按照Le Douarin的方法辨别鹌鹑囊胚细胞和鸡囊胚细胞。

39. 第三节 禽类繁殖生物技术 三、家禽的转基因技术 （一） 转基因技术 1、成熟卵泡微注射法 即向母鸡排卵前成熟卵泡中注射外源基因。Shuman（1986）注射反转录病毒，Kopchich注射牛GH基因。 2、受精卵原核微注射法 注射部位是受精卵胚盘质膜下方20um处的细胞质。 3、单细胞受精卵微注射法 Sang等和Perry等用微注射法将CMVIElacZ环形质粒注入受精卵中央，之后进行体外培养,在胚胎原肠胚期，表达β-gal酶活性。外源基因散在细胞质中, 并没有整合到染色体中。

40. 第三节 禽类繁殖生物技术 三、家禽的转基因技术 （一） 转基因技术 4、转染1日龄胚盘法 鸡产蛋后立即收蛋并储存在15℃。在不损伤壳膜的情况下，去除部分蛋壳，定位胚盘，用玻璃毛细管向胚盘注射1-100μg的pBGH-4DNA，正常孵化。 5、反转录病毒法 将反转录病毒中与病毒增殖有关的基因切除掉，并插入外源基因，来感染鸡的胚盘。 6、胚胎干细胞法（ES细胞） 胚胎干细胞具有发育上的全能性,注射到动物囊胚后可参与宿主胚胎的构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，因此可将其作为一种载体，导入外源基因，获得转基因动物。

41. 第三节 禽类繁殖生物技术 三、家禽的转基因技术 （一） 转基因技术 7、原始生殖细胞（PGCs）操作法PGCs介导的转基因技术在原理和方法上与ES细胞技术相似，但是不同之处在于PGC是配子的原始细胞，参与性腺的形成。 8、精原干细胞转染法 （1）精原干细胞体外转染外源基因后再移植入已消除内源生精细胞的受体睾丸内，最后形成精子生产转基因动物；（2）在活体睾丸内直接注射转染液，在体内转染精原干细胞后形成携带有外源基因的精子生产转基因后代。

42. 第三节 禽类繁殖生物技术 三、家禽的转基因技术 （一） 转基因技术 9、精子载体法在受精时由精子将外源基因带入卵中，形成雄原核并能准确地找到雌原核，利用这一特性可以将外源DNA通过精子送到目标及在适当的时间成功地进行整合。 10、基因打靶技术将细胞基因组中的某一序列克隆并加以改造后重新导入细胞中，这一序列就可以与基因组内的同源序列发生重组，从而将改造后的基因转移到基因组内，实现基因的定位突变。

43. 第三节 禽类繁殖生物技术 三、家禽的转基因技术 （二）家禽转基因研究的应用 1、促进家禽生长，提高产品质量 2、生产药物蛋白 3、鸡的抗病育种