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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征

第七章 蛋白质的分离、纯化和表征. 一、蛋白质的酸碱性质. 蛋白质是两性电解质 可解离基团：  - 氨基，  - 羧基，侧链 R 基团 蛋白质等电点： 在某一 pH 值，蛋白所带正负电荷相等，即净电荷为零时溶液的 pH 称为该蛋白等电点。. 二、蛋白质分子大小与形状. （一）根据化学组成测定最低分子量 例：肌红蛋白含铁量为 0.335% ，其最小分子量是多少？血红蛋白含铁量也是 0.335% 。试求其分子量。 解：肌红蛋白的分子量为： 100 ： 0.335=M ： 56 M=100*56/0.335=16716.4 血红蛋白的分子量为：

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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征

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Presentation Transcript

  1. 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征

  2. 一、蛋白质的酸碱性质 • 蛋白质是两性电解质 • 可解离基团：-氨基， -羧基，侧链R基团 • 蛋白质等电点：在某一pH值，蛋白所带正负电荷相等，即净电荷为零时溶液的pH称为该蛋白等电点。

  3. 二、蛋白质分子大小与形状 • （一）根据化学组成测定最低分子量 例：肌红蛋白含铁量为0.335%，其最小分子量是多少？血红蛋白含铁量也是0.335%。试求其分子量。 • 解：肌红蛋白的分子量为： • 100：0.335=M：56 • M=100*56/0.335=16716.4 • 血红蛋白的分子量为： • 100：0.335=M：（456） M=66865.7

  4. （二）几种测定蛋白分子量方法 • 1、渗透压法：=cRT/Mr • 2、测定扩散系数法:随Mr增加而降低 • 3、沉降法 • 规定10-13秒为一个单位，称为沉降系数单位，用S表示。 • *4、凝胶过滤法 • **5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法

  5. 凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法测定蛋白质分子量凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法测定蛋白质分子量 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白分子量 测定蛋白 标准蛋白 logMr=K1-K2R

  6. 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 • 1、蛋白质溶液是一种胶体溶液； • 水化作用，双电层结构 • 2、蛋白质沉淀 • （1）盐析：加入中性盐，破坏蛋白水化层引起沉淀 • （2）有机溶剂沉淀：加入极性有机溶剂，脱水化层，破坏双电层 • （3）重金属盐沉淀：结合成不溶性盐 • （4）加热变性

  7. 蛋白质分离纯化的几个基本原则 四、蛋白质分离纯化的基本原则 • 1、选择好的材料 • 2、前处理：匀浆或捣碎等 • 3、粗分离：盐析，有机溶剂沉等 • 4、细分离：凝胶过滤，离子交换等

  8. 五、蛋白质的分离纯化方法 • （一）根据分子大小不同： • 1、透析：利用蛋白质分子不能透过半透膜，使蛋白质和其他小分子分开。 • 2、凝胶过滤：利用蛋白质分子大小不同将蛋白分开。

  9. 分子筛层析的工作原理 凝胶过滤的工作原理 也叫分子筛层析

  10. （二）根据溶解度差别： • 1、等电点沉淀法：等电点时蛋白质溶解度最低，不同蛋白具有不同等电点。 • 2、盐析法 • 3、有机溶剂法

  11. 原理 • （三）根据电荷不同： • *离子交换层析

  12. 离子交换层析的洗脱 离子交换层析的洗脱过程示意

  13. 蛋白质分离纯化的其它方法 • 1、亲和层析 • 2、疏水作用层析 • 3、金属螯合层析：Ni2+-柱

  14. 蛋白质的定量法 蛋白质的定量法 • 凯氏(Kjeldahl)定氮法: 浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 • 双缩脲(biuret)法:CuSO4与肽链的氨基结合 • Folin-Phenol法:芳香族氨基酸侧链发色 • 紫外法:280纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) • Bradford法: 考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化 • BCA (bicinchoninic acid)法:FDA唯一认可

  15. 习题 • 盐析作用 疏水相互作用 透析 • *分离纯化蛋白质主要根据蛋白质的哪些性质 • A 分子的形状和大小 B 粘度不同 • C 溶解度不同 D 溶液的pH值 E 电荷不同 • *蛋白质胶体溶液的稳定因素是： • A 蛋白质颗粒在溶液中进行布朗运动，促使其扩散 • B 蛋白质分子表面有水膜 • C 蛋白质溶液粒度大 • D 蛋白质分子带有同性电荷 • 凝胶过滤法测定蛋白质分子量是根据不同蛋白质带电荷多少进行的。 • 用透析法可解开蛋白质中的二硫键。 • SDS-PAGE测定蛋白质分子量的方法是根据蛋白质分子所带电荷不同。

  16. 习题 • 在水溶液中，蛋白质溶解度最小时的pH值通常就是它的等电点。 • 已知牛血清白蛋白含色氨酸0.58%(按重量算),色氨酸分子量为204。 • (1)计算最低分子量； • (2)用凝胶过滤测得牛血清白蛋白分子量大约为7万,问该分子中含有几个Trp残基。 • 一种酶分子量为360,000, 在酸性环境中可解离为二个不同成分, 其中一个成分分子量为120,000, 另一个为60,000. 大的占总蛋白的三分之二, 具有催化活性; 小的无活性. 用β-巯基乙醇处理时, 大的颗粒即失去催化活性, 并且它的沉降系数减小, 但沉降图案上只呈现一个峰. 关于该酶的结构可做出什么结论?

  17. 在某一溶液中含有三种蛋白质，其性质如下： • 蛋白 相对分子量 等电点 • A 40000 8.5 • B 40000 5.9 • C 60000 5.9 • 试设计一个方案分离纯化这三种蛋白质。 • 请分别阐述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析分离蛋白质的原理，并比较这两种方法分离蛋白质的异同点。

  18. 请分别阐述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析分离蛋白质的原理，并比较这两种方法分离蛋白质的异同点。请分别阐述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析分离蛋白质的原理，并比较这两种方法分离蛋白质的异同点。

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