Dinamica molecolare

1. Dinamica molecolare Permette lo studio di processi dinamici complessi che avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio: stabilità delle proteine variazioni conformazionali folding proteico trasporto ionico/proteine in membrana Effetto di mutazioni/modifiche post-traduzionali Interazioni con ligandi o proteina/proteina

2. La superficie dell'energia libera configurazionale di una proteina è tipicamente "rugosa", poichè esistono molti stati metastabili, alcuni dei quali hanno un'energia molto vicina al minimo globale (problema della ricerca del minimo assoluto)  Inoltre la struttura nativa stessa non e’ statica ma esiste in un ensemble di conformazioni

3. Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare = la configurazione molecolare in funzione del tempo, ovvero come variano nel tempo le posizioni, le velocità e le accelerazioni degli atomi della molecola. Il sistema viene trattato secondo la legge del moto newtoniano e si parla di simulazioni di dinamica molecolare classica. Tutti gli atomi del sistema sono trattati secondo un campo di forze che ne descrive energie di legame e non legame.

4. DINAMICA MOLECOLARE: esplorazione DIVERSE CONFORMAZIONI e supera barriere energetiche MM e MD di sistemi proteici Campione di DIVERSE CONFORMAZIONI intorno a diversi minimi MD: energia potenziale + energia CINETICA

5. DINAMICA MOLECOLARE: esplorazione DIVERSE CONFORMAZIONI e supera barriere energetiche MM e MD di sistemi proteici Campione di DIVERSE CONFORMAZIONI intorno a diversi minimi MD: energia potenziale + energia CINETICA

6. CAMPO DI FORZA per MD

7. DINAMICA MOLECOLARE: esplorazione DIVERSE CONFORMAZIONI e supera barriere energetiche MM e MD di sistemi proteici Campione di DIVERSE CONFORMAZIONI intorno a diversi minimi MD: energia potenziale + energia CINETICA

8. MM e MD di sistemi proteici STRUTTURA/ MODELLO 3D ANALISI SIMULAZIONE • studio dinamico delle proprietà molecolari e strutturali di un sistema proteico • studio interazione proteina/ligando, proteina/proteina, proteina/cofattore… • analisi di cambiamenti conformazionali • studio di mutanti in silico • analisi della flessibilità strutturale • refinement di modelli di struttura 3D • protein folding/unfolding • utile guida per validazioni sperimentali o per spiegare dati sperimentali Non adatto a processi che prevedono rottura/formazione legami – cambiamenti elettronici nel sistema

9. STUDIO PROPRIETA’ DINAMICHE E MOLECOLARI • MD: studio EVOLUZIONE di un sistema NEL TEMPO MM e MD di sistemi proteici Raggiungimento condizione EQUILIBRIO termodinamico CAMPIONAMENTO SIGNIFICATIVO della superficie di potenziale del sistema Studio PROPRIETA’ DINAMICHE E MOLECOLARI di una proteina o un complesso proteico nel tempo

10. CHECK STRUTTURA 3D di partenza • generazione della TOPOLOGIA • - assegnazione atom typesulla base del campo di forze • - connettività tra atomi e cariche per ogni atom type • - !!!!! Protonazione delle his PREPARAZIONE DEL SISTEMA • OTTIMIZZAZIONE DELLA STRUTTURA DI PARTENZA • ALGORITMO DI MINIMIZZAZIONE DELL’ENERGIA • TRATTAMENTO DEL SOLVENTE • ESPLICITO (atomi del solvente trattati esplicitamente) • - IMPLICITO (uso di diverse costanti dielettriche) • NEUTRALIZZAZIONE DEL SISTEMA • - Aggiunta di CONTROIONI (Na+ / Cl-)

11. PARAMETRI PER LA SIMULAZIONE • TEMPERATURA DI SIMULAZIONE e accoppiamento al bagno termico (termostato di Berendsen) • CUTOFF PER INTERAZIONI DI Coulomb e Van DerWaals(sopra al cutoff (10-15Å) interazioni tra gli atomi non considerate nel calcolo) • campo di forza ottimizzato per proteine (GROMOS, CHARMM, AMBER…) • ensemble :NVT vs NPT (meglio NPT cosi’ la pressione oltre che la temperatura e’ mantenuta costante)

12. TRATTAMENTO DEL SOLVENTE • ESPLICITO (condizioni periodiche) SIMULAZIONE PRODUTTIVA • TEMPERATURA (300 K) DI SIMULAZIONE • CUTOFF PER INTERAZIONI DI Coulomb e Van DerWaals • ensemble : NVT vs NPT (PRESSIONE DI SIMULAZIONE  1 bar) • durata : ~ 10s/100s ns to few μs • timestep: 2-4 fs controllo atomi a alta vibrazione (H) [SHAKE, LINCS] • accoppiamento al bagno termico e al barostato meno frequente (τ > timestep) • sistema non vincolato

13. teoricamente possibile calcolare tutte le forme di una struttura e scegliere quella di minimo energetico assoluto • MA • x 1 prot 200 aa, se assumo n° possibili conformazioni per ogni aa = 3, 2.66 x 1095 possibili conformazioni. Tempi più lunghi dell’età dell’universo per una simulazione computazionale SIMULAZIONI DI PROTEIN FOLDING Bond vibration Isomeris- ation Water dynamics Helix forms Fastest folders typical folders slow folders 10-15 femto 10-12 pico 10-9 nano 10-6 micro 10-3 milli 100 seconds Where we need to be MD step Long MD run Where we’d love to be

14. STUDIO PROPRIETA’ DINAMICHE E MOLECOLARI • MD: studio EVOLUZIONE di un sistema NEL TEMPO MM e MD di sistemi proteici Raggiungimento condizione EQUILIBRIO termodinamico CAMPIONAMENTO SIGNIFICATIVO della superficie di potenziale del sistema Studio PROPRIETA’ DINAMICHE E MOLECOLARI di una proteina o un complesso proteico nel tempo DINAMICHE suf. Lunghe da garantire il raggiungimento di uno stato di equilibrio Diverse simulazioni per lo stesso sistema a partire da ≠ condizioni iniziali (struttura di partenza ≠, velocità iniziali ≠)

15. MD CLASSICA DETERMINAZIONE STATI DI EQUILIBRIO • VALUTAZIONE PROPRIETA’ TERMODINAMICHE nel tempo (oscillazioni intorno a valori costanti): • TEMPERATURA E PRESSIONE • VOLUME DEL SISTEMA • ENERGIA TOTALE E POTENZIALE • RAGGIO DI GIRAZIONE (Rg, paragone con dato sperimentale) • ROOT MEAN SQUARE DEVIATION (RMSD) rispetto a struttura riferimento: • riferimento (r0): struttura iniziale • mainchain o carboni alpha

16. ANALISI di proprietà di interesse ROOT MEAN SQUARE FLUCTUATION (RMSF) • CALCOLATO IN FUNZIONE DEL NUMERO DI RESIDUI • Riferimento = struttura media Set di atomi = mainchain o carboni alpha • INDICE DI FLESSIBILITA’ MOLECOLARE

17. ANALISI di proprietà di interesse INTORNO DI UN RESIDUO • riferimento: centro di massa del residuo di interesse • cutoff: x nm (es 0.5 nm) • calcolati ad ogni step gli atomi (o residui) collocati entro una distanza x dal riferimento impostato • per ogni atomo (o residuo) può essere analizzato l’andamento della distanza nel tempo e il grado di PERSISTENZA nell’intorno del riferimento (P-degree %)

18. Meccanismo di interazione tra E3 classe HECT e enzima E2

19. Itch membro famiglia E3 HECT • Itch riconosce E2 UbcH7 (famiglia 15 di E2 (Michelle et al.)) • contengono dominio N-terminale C2 (dip. da Ca2+ e per legame a fosfolipidi) • domini WW multipli • dominio C-terminale catalitico HECT (350 aa) (riconoscimento E2) • dominio C2: media localizzazione • moduli WWW reclutano substrato riconoscendo motivi ricchi in Pro (PPXY) op pS/ppT+P

20. HECT domain formato da due domini strutturali distinti: lobo N-terminale (sito legame x E2) e lobo C-terminale (sito catalitico) - connessi da hinge flessibile • regolazione att.cat. HECT con 2 possibili • meccanismi: Itch mediata • 1. da associazione tra dominio HECT e regione • centrale che include motivi WWW • cambiamento conformazionale indotto • da fosforilazione a opera JNK1 • 2. regolazione attraverso interazioni tra HECT • E dominio C2 – int. Intramol. Inibiscono • attivita’ E3 (attivata da un complesso proteico • che fa da attivatore allosterico ed e’ regolato • Da fosforilazione)

21. Regione Hinge tra lobo N e C sembra importante per binding con E2 (da studi x-ray) • Hp cambiamento conformazionale che altera orientamento tra i due lobi per permettere reazione perché distanza tra E2 e Cys-E3 è troppo lunga per permettere trasferimento Ub • Verdecia et al., 2003, Mol Cell: ruotato angoli diedri alcuni residui dell’HINGE (Met 804, Gln 805, Glu 806) che porta a diminuzione distanze tra E2 e Cys-E3 • Hp anche dimensioni Ub e’ stato stimato che distanza dovrebbe essere 2.5-3 Å perché lo scambio abbia luogo • Hp Raimondo et al.: un comportamento dinamico piu’ complesso dell’hinge forse non limitato a pochi residui • Necessita’ studio forze molecolari in gioco

22. Un comportamento dinamico piu’ complesso dell’hinge forse non limitato a pochi residui • Necessita’ studio forze molecolari in gioco • Studio proprieta’ dinamiche sistemi cosi’ complessi non di facile accesso con tecniche sperimentali ma affrontabile da tecniche computazionali • Usano dinamica molecolare, calcoli di energia libera e tecniche di modelling per studiare interazione tra domino HECT e UbcH7 e per chiarire meccanismo di trasferimento di Ub a HECT e proteina target • ULTERIORE COMPLICAZIONE allo STUDIO SPERIMENTALE: In vitro formazione intermedio tioestere ha alto tasso conversione e rende difficile determinazione strutturale via NMR o X-ray

23. METODI • Dominio HECT di Itch9 modellato per homology modelling • Ricerca con Blast in PDB dei templati e proteina a struttura nota con piu’ basso E-value (WWP1 HECT, pdb code 1ND7) • Id. seq 80% (caso adatto al modelling per omologia) • Homology modelling con server automatico SwissModel • MODELLO DEL COMPLESSO E2-E3: Posizione relativa di Itch e UbcH7 modellata usando come riferimento complesso X-ray di UbcH7 con un altro E3, E6AP-UbcH7 (codice pdb 1C4Z) in seguito a sovrapposizione ottimale di atomi della mainchain di Itch modellato e di E6AP X-ray • Modellano HECT-UbcH7-Ub in una conformazione putativa “cataliticamente attiva” secondo il modello di Verdecia et al. • MODELLO E2Ub-E3: Orientamento Ub in complesso a E2 preso da str. NMR di riferimento Ubc1-Ub (codice pdb 1FXT, Ubc1 e’ della famiglia 1) (sempre per sovrapposizione ottimale mainchain) • Ottimizzazione energetica di tutto il complesso ternario modellato con 200 step di minimizzazione via meccanica molecolare con campo di forze GROMOS

24. METODI • SIMULAZIONI MD • Programma NAMD • Solvente esplicito (box d’acqua) • Neutralizzazione sistema con 4 ioni sodio • Time step per la simulazione 2 fs • Simulazione in NPT 300K e 1 atm • MD produttiva 3.5 ns, dopo alcuni passaggi iniziali di preparazione • Simulazione molto corta da cui non possono dedurre larghi riarrangiamenti conformazionali • ANALISI MODI NORMALI • A partire da conformazioni diverse del complesso (modello iniziale e strutture estratte dalla dinamica) • Permette descrizione con modello coarse-grain (semplificato con pseudoatomi) no time-consuming di riarrangiamenti che possono avvenire nella struttura (large-scale motions).

25. METODI • ALANINE SCANNING IN SILICO • Usano modulo di Rosetta per mutagenesi che permette di predire cambiamenti nell’energia libera di binding in seguito a mutazioni di residui all’interfaccia di interazione tra molecole proteiche • (descrive contributi che derivano da interazioni di van der Waals, solvatazione/desolvatazione e legami a idrogeno) • Dai modelli del complesso definiscono i residui all’interfaccia di interazione tra E2 ed E3 (saranno quelli per cui diminuisce maggiormente l’accessibilita’ al solvente in seguito all’interazione) e su questi residui si fa alanine scanning in silico e si calcola come cambia energia libera rispetto alla variante wt del complesso. • I residui con maggiori cambianenti di energia libera di binding dovrebbero essere quelli piu’ importanti per la stabilizzazione del complesso.

26. SUPERFICIE INTERAZIONE TRA HECT E UbcH7 • Superfici di potenziale elettrostatico delle due molecole sono complementari • Includono regione centrale idrofobica (Phe63, Pro97, Ala98 di UbcH7 e Phe648, Val691, Met703, Val741, Leu688 di HECT) sia in HECT che UbcH7 • Regione idrofobica circondata da residui carichi (positiva su E2 e negativa su HECT) TIPICAMENTE NEI COMPLESSI PROTEINA-PROTEINA, i residui idrofobici sono localizzati nella regione piu’ interna dell’interfaccia di interazione/quelli carichi intorno I residui carichi sono quelli che definiscono l’orientamento/specificita’ e importanti nel determinare il riconoscimento iniziale, Quelli idrofobici fondamentali nella Stabilizzazione una volta Che il complesso si e’ formato

27. SUPERFICIE INTERAZIONE TRA HECT E UbcH7 • Predicono interazioni idrofobiche e ioniche all’interfaccia tra HECT e UbcH7 In linea con quanto generalmente atteso per interazioni intramolecolari in cui interazioni idrofobiche stabilizzano il complesso e elettrostatiche orientano le molecole e conferiscono specificita’

28. ALANINE SCANNING IN SILICO • Forniscono stima di contributo di ogni singolo residuo coinvolto nell’interazione • Modulo di mutagenesi di Rosetta (RosettaDock), in principio simile a esperimento Ala-scanning • Stima di influenza sull’energia libera di binding di mutazioni a Ala di ogni singolo residuo all’interfaccia di interazione • ∆ ∆Gbind > 1.0 kcal/mol cut-off per residui che sono hot-spot di interazione, cioè residui essenziali per il mantenimento del complesso, perché attesto che con questa soglia si identificano l’80% dei residui hot-spot (test fatto su 19 complessi proteina-proteina X-ray nel 2002). • -1.0 kcal/mol <∆ ∆Gbind < 1.0 kcal/mol mutazione neutrale (contributo debole al complesso) • se ∆ ∆Gbind < -1.0 kcal/mol indica che mutazione ad Ala potrebbe potenzialmente aumentare affinita’ di interazione • 2 aa di HECT (Phe175, Trp181) e uno di UbcH7 (Phe63) hanno ∆ ∆Gbind positivo - int.idrofobiche maggior contributo a interazione • NB probabilmente coinvolti in interazioni di carattere aromatico considerando la natura dei residui in gioco

29. SIMULAZIONI DINAMICA MOLECOLARE • simulazione MD gia’ equilibrata dopo 2 ns (dato non mostrato) • Monitorano stabilita’ ponti salini tra aa in Tabella 2 durante l’intera simulazione (distanza nel tempo tra aa coinvolti nel ponte salino) • Distanza tra Asp700 (su HECT) e Lys9 (UbcH7) aumenta dopo 2 ns oltre la soglia di 6 Å indicando un interazione piu’ debole e non fondamentale al mantenimento complesso • Distanza tra Asp681 (HECT) e Lys64 (UbcH7) stabilizzato durante simulazione e loro distanza diminuisce dopo 2 ns.

30. ANALISI MODI NORMALI • Per individuare proprieta’ dinamiche e cambiamenti conformazionali a lungo raggio • Modi normali evidenziano i modi vibrazionali a frequenza + bassa • Richiede valutazione evoluzione del sistema nel tempo su scale temporali di decine ns, computazionalmente costoso per sistemi cosi’ grandi • Usano un metodo che implementa un modello coarse-grain per descrivere la proteina (pseudoatomi che catturino la natura di ciascuno dei singoli residui) • Individuano 2 regioni hinge principali in cui sono localizzati i movimenti a piu’ bassa frequenza • HINGE 1: Hinge loop region da Met785 a • Gln786 come proposto da Verdecia et al. • HINGE 2: vicino a N-lobe con regione di • Binding E2 e si puo’ vedere come un asse • immaginrio che collega Gly673 e Gly749 • (N-lobe axis) • Questo hinge divide il domino N-lobe in 2 • sottodomini sono connesse da due loop • che potrebbero essere responsabili della • flessibilita’ osservata

31. ANALISI MODI NORMALI • Se si Hp rotazione attorno a hinge loop region e N-lobe axis, la distanza tra SH delle cys catalitiche di E2 e E3 diventano circa 3.5 Å (compatibile con trasferimento Ub) • Controllo: ottengono stessi risultati se la struttura di partenza non e’ il modello cataliticamente competente di Verdecia et al. e anche usando due strutture prese dalla MD • Dimostrano presenza di una varieta’ di • cambiamenti conformazionali in dominio HECT • non limitati a 3 residui contigui Propongono modello dell’intermedio e forniscono una descrizione dei cambiamenti conformazionali che portano al riconoscimento e trasferimento dell’Ub da E2 a E3

32. ANALISI MODI NORMALI • In vitro formazione intermedio tioestere ha alto tasso conversione e rende difficile determinazione strutturale via NMR o X-ray • Propongono modello dell’intermedio e forniscono una descrizione dei cambiamenti conformazionali che portano al riconoscimento e trasferimento dell’Ub da E2 a E3

33. INTERESSE FARMACOLOGICO E MODELLO AZIONE Itch • Molti inibitori del proteasoma sono in studio o in fase di sviluppo o trials clinici (es. bortezomide) però problemi di specificita’ • La regolazione di UPS (Ubiquitin-mediated Proteasome System) è critica perché spesso questo sistema e’ coinvolto in sviluppo di tumori (es. proteolisi aberrante di substrati coinvolti nella regolazione ciclo cell…). • Sviluppo di composti che inibiscano specificatamente componenti del sistema dell’Ub • Organizzazione gerarchica di UPS offre ampia fonte di potenziali target farmacologici (molte centinaia E3, decine di E2) • Modello proposto nello studio puo’ essere utile framework per guidare progettazione di inibitori per Itch. • Potenziali regioni di interesse per drug development: • Sito catalitico E3 • Regione hinge • residui per interazione HECT-E2 e HECT-substrato (inibizione • Del reclutamento di E2) MODELLO DI TRASFERIMENTO Ub da E2 a HECT