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Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien

Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden. Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden. Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien. Doreen Kunze

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Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien

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  1. Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien Doreen Kunze 21.07.05

  2. Einleitung 2 • Prostatakarzinom (PCa) • häufigste Krebserkrankung bei Männern • zweithäufigste Krebs-Todesursache • Lebenszeitrisiko: • zu erkranken: 9,6 % • zu sterben: 3,2 % • Häufigkeitsgipfel zw. 70. – 75. Lebensjahr • genetisch und tumorbiologisch sehr heterogen

  3. Einleitung 3 • Tumorentwicklung • Überexpression von Onkogenen und/oder funktionelle Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (TSG) • PCa: • Onkogene: Progression • TSG: Entstehung • → häufig Allelverluste (LOH – loss of heterozygosity) auf den Chromosomen- abschnitten 8p und 13q

  4. BRCA2 C 13 13 RB1 Chromosom 13 In situ-Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP-mRNA (Schmidt et al. 2001) Einleitung 4 P38IP (C13orf19, FAM48A) • lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei Tumorsuppressorgenen • LOH-Ereignisse • mRNA-Expression in primären PCa reduziert • Hypothese:Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe • → verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der • P38IP-mRNA-Expression

  5. zelluläre Kinase siRNA Bildung von RISC RISC siRNA-Entwindung ATP ADP + Pi Aktivierter RISC Anlagerung von RISC an Target-mRNA Zellkern polyA Target-mRNA Target-mRNA- Spaltung polyA polyA Target-Gen Sequenzspezifisches Gensilencing Einleitung 5 siRNA (small interfering RNA) • Bestandteil der RNA- • Interferenz • posttranskriptionelle • Geninhibierung • 2 nt-3`-Überhänge • 5`-Phosphatgruppen • antisense-Strang aktiviert • RISC (RNA induced • silencing complex) modifiziert nach D. Bauer

  6. Ziele 6 • Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene ? • Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK ? • Androgenabhängigkeit der P38IP-mRNA-Expression ?

  7. 24 – 72 h 20 – 68 h WST-1-Test Zellzählung RNA-Isolierung + qPCR Apoptosemessung Zellzyklustest Zellkoloniebildungstest Aussaat (PC-3, BPH-1) siRNA-Transfektion (4 h) 7 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition Zeit- und Konzentrationsabhängige Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression bei PC-3-Zellen: P38IP-mRNA-Expression/PBGD, normiert auf ns-siRNA • effektive, langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression

  8. 8 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition WST-1-Test → keine Kurz- und Langzeit- Proliferations- effekte Zellkoloniebildungstest

  9. Apoptosemessung (FACS) 4,3 % unbehandelt 5,5 % 4,9 % siRNA-D5 ns-siRNA 9 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition Zellzyklusverteilung → keine Zellzyklus- veränderungen → keine Veränderung der Apoptoserate

  10. 24 – 72 h 20 h 24 – 72 h WST-1-Test Zellzählung Apoptosemessung Zellzyklustest CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h) Aussaat (PC-3) Transfektion (4 h) 10 1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA-D5 und Chemotherapeutika • keine verstärkte Reduktion der Zellzahl • keine Apoptoseinduktion

  11. 11 1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA-D5 und Chemotherapeutika Zellzyklusverteilung • Zellzyklusarrest • keine Wachstums-veränderungen verglichen mit den Kontrollen 125fache Vergrößerung A: PC-3 siRNA-D5 B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid

  12. Zusammenfassung 1.Teil 12 Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene •  Langanhaltende und effektive Geninhibition durch siRNA • P38IP hat keinen Einfluss auf das Wachstum der untersuchten Prostatazelllinien • verminderte Expression nicht ursächlich mit PCa-Entstehung verbunden • möglicherweise mit Progression der Karzinome assoziiert oder Begleiterscheinung der zunehmenden genetischen Instabilität auf dem Chromosom 13q

  13. Quelle: www.cellsignalingtechnology.com 13 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK • P38IP = p38MAPK interacting protein • MAPK = mitogenaktivierte Proteinkinase • intrazelluläre Signalübertragung (Proteinkinasen-Kaskaden) • stressaktiviert • 4 Isoformen (α, β, γ, δ) • SB203580 inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle

  14. 14 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK Inhibition der P38IP- mRNA-Expression mit siRNA-D5 Expression und Phosphorylierungsstatus der p38MAPK Inhibition der p38MAPK durch SB203580 P38IP-mRNA-Expression

  15. unbehandelt unbehandelt unbehandelt siRNA-D5 siRNA-D5 siRNA-D5 ns-siRNA ns-siRNA Marker PC-3 p38MAPK (gesamt) β-Actin phospho-p38MAPK β-Actin Erntezeitpunkt nach Transfektion: 72 h 96 h 72 h 15 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK 1. Inhibition der P38IP-Expression mit siRNA-D5 • Phosphorylierungsstatus der p38MAPK ändert sich nicht

  16. 16 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse) 2. Inhibition der p38MAPK durch SB203580 • kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK

  17. 24 h 24 h 3 – 48 h Aussaat (LNCaP) Hormonfreies Medium Androgen R1881 (+ Bicalutamid) RNA-Isolierung + qPRC 3. Androgenabhängigkeit 17 • P38IP-mRNA-Expression ist nicht androgenabhängig

  18. Zusammenfassung 18 • P38IP besitzt keine Tumorsuppressor-funktion in den untersuchten Zelllinien • Genbezeichnung: C13orf19 oder FAM48A • kein Zushang • P38IP-mRNA-Expression ist androgen-unabhängig

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