Základy biochemie KBC / BCH

1. Základy biochemie KBC / BCH Metabolismus aminokyselin

2. Metabolismus aminokyselin • Odbourávání proteinů. • Deaminace aminokyselin. • Ornithinový (močovinový) cyklus. Osud uhlíkaté kostry aminokyselin. Biosyntéza aminokyselin. Další produkty metabolismu aminokyselin. Fixace dusíku.

3. Odbourávání proteinů • Délka existence proteinů se pohybuje od několika minut k týdnům a déle. • Buňky kontinuálně odbourávají proteiny na aminokyseliny a syntetizují proteiny. • Důvodem obměny proteinů je: • 1. Proteiny jako skladovatelná energie (?!). V čase metabolické potřeby se odbourávají a uhlíkatá kostra se využívá např. k syntéze glukosy ( svalové proteiny). • 2. Odstranění abnormálních proteinů jejichž přítomnost v buňce by buňku vyřadila z činnosti. • 3. Realizace regulačních mechanismů v buňce odstraněním některých enzymů nebo jejich regulátorů.

4. Poločasy existence některých proteinů krysích jater: • Enzymy s krátkou dobou existence Poločas (h) • Ornithindekarboxylasa 0, 2 • RNA polymerasa I 1, 3 • Tyrosinaminotransferasa 2, 0 • Serindehydratasa 4, 0 • Fosfoenolpyruvátkarboxylasa 5, 0 • Enzymy s dlouhou dobou existence • Aldolasa 118 • Glyceraldehydfosfátdehydrogenasa 130 • Cytochrom b 130 • Laktátdehydrogenasa 130 • Cytochrom c 150

5. LYSOSOMY-lysosomální degradace. • LYSOSOMY jsou kulovité organely nacházející se v cytosolu eukaryotních buněk, od něhož jsou odděleny jednou (dvojvrstevnou) membránou. Jsou místem intracelulárního štěpení (trávení) biologických makromolekul a lipidů; obsahují hydrolytické enzymy (kathepsiny) schopné rozložit pohlcený obsah (např. při fagocytose), eventuálně i vlastní makromolekuly buňky (autolysa, např. za anaerobních podmínek v odumřelém organismu). • Asi 40 různých lysosomálních hydrolas zajišťuje tuto degradační aktivitu; jejich pH-optimum je v kyselé oblasti (v cytosolu jsou inaktivní). Tzv. primární lysosomy, obsahující lysosomální hydrolasy, vznikají odškrcením od Golgiho aparátu. Fůzí s váčky, vzniklými endocytosou (endosomy), vytvářejí posléze tzv. sekundární lysosomy, v nichž probíhá vlastní intracelulární trávení. • U dobře živených buněk je lysosomální degradace neselektivní. U hladovějících je degradace selektivní – zachovávají se důležité enzymy a regulační proteiny. Odbourávají se proteiny obsahující pentapeptidovou sekvenci Lys-Phe-Glu-Arg-Gln (KFERQ). S lysosomální degradací je spojena např. rheumatoidní arthritida.

6. Jadérko, 2. Jádro, 3. Ribosomy, 4. Váčky(měchýřky), 5. Drsné ER, 6. Golgiho aparát, 7. Cytoskelet, 8. Hladké ER, 9. Mitochondrie, 10. Vakuola, 11. Cytosol, 12. Lysosom, 13. centriola.

7. Ubiquitin • U eukaryotních buněk působí při degradaci také proces spotřebovávající ATP a zahrnující ubiquitin. • Ubiquitin je monomerní protein obsahující 76 aminokyselin. Z jeho názvu plyne jeho všudypřítomnost. • Proteiny určené k degradaci jsou označeny kovalentní vazbou s ubiquitinem. Proces probíhá ve třech stupních za účasti tří enzymů. • A) Ubiquitin aktivační enzym E1 – ubiquitin se za účasti ATP připojí na E1 • B) Ubiquitin konjugační enzym E2 – přenos ubiquitinu na E2 přes terminální karboxyl ubiquitinu a Cys E2 • C) Ubiquitin-protein ligasa E3 – přenos aktivovaného ubiquitinu na e-aminoskupinu Lys odstraňovaného proteinu (isopeptidová vazba) • Aby byl protein odbourán musí být označen řetězcem minimálně čtyř ubiquitinů, ale až padesát – polyubiquitinový řetězec.

8. Struktura ubiquitinu. Isopeptidová vazba ubiquitinu s cílovým proteinem. Ubiquitin

9. Struktura ubiquitinu – stužkový model. Nobelova cena za chemii 2004 „for the discovery of ubiquitin-mediated protein degradation" Aaron Ciechanover Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel, Avram Hershko Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel and Irwin Rose University of California, Irvine, USA Ubiquitynylace proteinů

10. Proces ubiquitinylace. E1-aktivační enzym, E2-konjugační enzym, E3- ubiquitin-protein ligasa

11. Proteasom • Ubiquitinem (ubiquitynylace) označené proteiny se proteolyticky odbourávají v procesu zahrnujícím velký (2100 kD, 26S) multiproteinový komplex zvaný 26S proteasom, který má na obou koncích čepičku označenou 19S cap. Čepičky rozpoznávají ubiquitynylovaný protein. • Ubiquitynylovaný protein vstoupí do dutiny proteasomu bez odštěpeného řetězce ubiquitinů, které se recyklují. Protein uvnitř dutiny proteasomu je hydrolyticky štěpen na aminokyseliny.

12. Elektronoptický snímek proteasomů z Xenopus laevis Vlevo: červená střední část 26S, žluté čepičky 19S. Vpravo – pohled shora. Proteasom

13. Kiss of Death • http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2004/animation.html

14. Deaminace aminokyselin • Volné aminokyseliny mají původ, buď z degradace buněčných proteinů, nebo z potravy. Žaludeční proteasa pepsin a pankreatické proteasy trypsin, chymotrypsin a elastasa a řada další endo- a exopeptidas hydrolyzují polypetidy na oligopetidy a posléze až na aminokyseliny. Aminokyseliny jsou absorbovány střevní sliznicí a transportovány krevním řečištěm do dalších tkání. • Odbourávání aminokyselin probíhá intracelulárně. Prvním krokem je odstranění a-aminoskupiny. Většinou ve formě amoniaku, který je vylučován, buď přímo, nebo přes další sloučeniny z organismu. • Uhlíkatý skelet aminokyselin (a-oxokyseliny) je odbouráván na CO2 a H2O nebo převeden na glukosu, acetyl CoA nebo ketolátky. • Odstranění a-aminoskupiny: A) Transaminace B) Oxidativní deaminace

15. Přehled odbourávaní (katabolismu) aminokyselin

16. Transaminace (aminotransferasy EC 2.6.1 -).Přenos aminoskupiny na oxokyselinu.

17. Transaminace. Enzymy aminotransferasy (transaminasy) s koenzymem pyridoxal-5´-fosfátem (PLP). EC 2.6.1.1 Aspartáttransaminasa; Glutamát-oxaloacetáttransaminasa; Glutamátaspartáttransaminasa; Transaminasa A

18. Prekurzorem PLP je pyridoxin, vitamin B6.

19. PLP je pevně vázán na enzym přes imino vazbu (Schiffova báze) na e-aminoskupinu Lys. Pyridoxamin-5´-fosfát (PMP).

20. Převedení aminokyseliny na 2-oxokyselinu.Transaminace. Aminoskupina aminokyseliny působí jako nukleofil za tvorby aldiminu.

21. Tautomerizace. Aminokyselina-PLP Schiffova báze tautomerizuje na 2-oxokyselinu-PMP Schiffovu bázi – ketimin.

22. Hydrolýza. 2-Oxokyselina-PMP-Schiffova báze je hydrolyzována na PMP a 2-oxokyselinu.

23. Transaminace. Převod a-oxokyseliny na aminokyselinu. • Převod zahrnuje stejné tři kroky, ale v opačném pořadí: • A) PMP reaguje s a-oxokyselinou za tvorby Schiffovy báze. • B) a-Oxokyselina-PMP Schiffova báze tautomerizuje za tvorby aminokyselina-PLP Schiffova báze. • C) e-Aminoskupina Lys v aktivním místě atakuje aminokyselinu-PLP Schiffova báze v transiminační reakci za tvorby aktivní enzym-PLP Schiffova báze a současného uvolnění nově vzniklé aminokyseliny. • V reakci vzniká rezonančně stabilní Ca karbanion stabilizovaný protonizovaným dusíkem pyridinia. Při transaminaci se uvolňuje a proton. Při jiných enzymových reakcích se mohou odštěpovat vazby b a c. Např. odštěpení b vede k dekarboxylaci aminokyseliny za vzniku aminu.

24. Aminotransferasy • Substráty většiny aminotransferas jsou 2-oxoglutarát a oxaloacetát a pyruvát. Aminotransferasové reakce jsou reversibilní a podílí se tak i na syntéze aminokyselin. • Přítomnosti aminotransferas ve svalových a jaterních buňkách se využívá k diagnostickým účelům. Klinické měření se nazývá SGOT (serum glutamátoxaloacetáttransaminasa), také aspartáttransaminasa, AST, a SGPT (serum glutamátpyruváttransaminasa, nebo alanintransaminasa, ALT). Vysoké aktivity těchto enzymů v krevním séru indikují porušení svalové nebo jaterní tkáně (infarkt myokardu, zánět jater). • Jediná aminokyselina, která nepodléhá transaminaci je Lys.

25. Oxidativní deaminace-glutamátdehydrogenasa EC 1.4.1.1-4 (GDH).Allosterická inhibice ATP a GTP, aktivace ADP a GDP. Proč ?? • GDH je mitochondriální enzym, jediný enzym, který využívá jak NAD+, tak NADP+ jako redoxní koenzym. Oxidace probíhá přenosem hydridového aniontu z a-uhlíku Glu na NAD(P)+. Meziproduktem je a-iminoglutarát, který je hydrolyzován na amoniak a a-oxoglutarát. Anaplerotická reakce. GDH je allostericky inhibována GTP a NADH, aktivována ADP a NAD+.

26. Ornithinový (močovinový )cyklus. • Živé organismy uvolňují nadbytečný dusík třemi způsoby: A) Vodní živočichové do vody jako amoniak - amonotelní. B) Suchozemští živočichové jako močovinu- ureotelní. C) Ptáci a suchozemští plazi jako močovou kyselinu a její soli – urikotelní.

27. Ornithinový (močovinový) cyklus publikován v roce 1932(první známý metabolický cyklus) H. Krebs a K. Henseleit.Syntéza močoviny probíhá v jaterních buňkách, částečně v matrix, částečně v cytosolu.Jeden dusík z NH3, druhý z Asp a uhlík z CO2.

28. Reakce močovinového cyklu – pět enzymů (dva mitochondriální, tři cytosolové). • Karbamoylfosfátsynthetasa (CPS) není součástí cyklu. Katalyzuje kondenzaci a aktivaci NH3 a HCO3- za tvorby karbamoylfosfátu při spotřebě dvou ATP. • U eukaryot existují dvě CPS – CPS I a CPS II. • Mitochondriální CPS I má jako zdroj dusíku amoniak a podílí se tak na syntéze močoviny. Reakce je prakticky ireversibilní a rychlost cyklu limitující. • Cytosolová CPS II má jako zdroj dusíku Gln a účastní se biosyntézy pyrimidinových nukleotidů.

29. Mechanismus působení CPS I • 1. ATP aktivuje HCO3-  karboxyfosfát + ADP. • 2. Amoniak atakuje karboxyfosfát, uvolňuje fosfát za tvorby karbamátu a Pi. • 3. Druhé ATP fosforyluje karbamát za tvorby karbamoylfosfátu.

30. Další enzymy močovinového cyklu: • Ornithintranskarbamoylasa. Přenáší karbamoylovou skupinu na ornithin citrullin. • Rekce probíhá v mitochondrii – ornithin je transportován dovnitř a citrullin do cytosolu. • Argininosukcinátsynthetasa. Vstup druhého dusíku do cyklu. Ureido kyslík citrullinu je aktivován ATP za tvorby citrullyl-AMP. Poté vstupuje Asp. Difosfát je difosfatasou rozkládán na dva Pi. • Argininosukcinasa. Enzym katalyzuje eliminaci fumarátu a oddělení Arg. Fumarát analogickou reakcí jako v citrátovém cyklu přechází na malát a poté na oxaloacetát-reakce probíhají v cytosolu a výsledný oxaloacetát vstupuje do glukoneogeneze. • Arginasa. Enzym katalyzuje hydrolýzu Arg na močovinu a ornithin, který je transportován zpět do mitochondrie. Močovina je odváděna do ledvin a močí ven z těla.

31. Karbamoylfosfátsynthetasová reakce

32. Lokalizace a enzymy ornithinového cyklu. 2- Ornithintranskarbamoylasa, 3- Argininosukcinátsynthetasa, 4- Argininosukcinasa, 5- Arginasa

33. Mechanismus argininosukcinátsynthetasy

34. Další osud fumarátu v cytosolu

35. Regulace močovinového cyklu • Karbamoylfosfátsynthetasa je allostericky aktivována N-acetylGlu. Se vzrůstajícím odbouráváním aminokyselin roste koncentrace Glu a syntéza N-acetylGlu - močovinový cyklus se urychluje. • Močovinový cyklus stejně jako glukoneogeneze a ketogeneze je lokalizován v játrech, ale slouží pro celý organismus. • Ostatní enzymy cyklu jsou pod kontrolou koncentrace svých substrátů.

36. Odbourávání uhlíkaté kostry aminokyselin – přehled • Aminokyseliny jsou odbourávány na sloučeniny, které mohou být metabolizovány na CO2 a H2O nebo využity při glukoneogenezi. • Odbouráváním aminokyselin u živočichů se obvykle získává 10 až 15 % metabolické energie. • Dvacet „standardních aminokyselin“ je odbouráváno na sedm metabolických meziproduktů: • Pyruvát, a-oxoglutarát, sukcinyl-CoA, fumarát, oxaloacetát, acetyl-CoA nebo acetoacetát. • Na tomto základě dělíme aminokyseliny do tří skupin: glukogenní, ketogenní a gluko i ketogenní. • Glukogenní aminokyseliny se odbourávají na pyruvát, • 2-oxoglutarát, sukcinyl-CoA, fumarát a oxaloacetát – jsou prekurzory glukosy. • Ketogenní aminokyseliny se odbourávají na acetyl-CoA a acetoacetát a mohou být převedeny na mastné kyseliny a ketolátky. Čistě ketogenní jsou Lys a Leu.

37. Zařazení aminokyselin podle produktů odbourávání jejich uhlíkaté kostry. • Aminokyseliny glukogenní: • Gly,Ala, Cys, Ser, Thr (odbourávají se na pyruvát); • Arg, Glu, Gln, Pro, His (odbourávají se na a-oxoglutarát); Ile, Met, Val (odbourávají se na sukcinyl-CoA); • Asp, Asn (odbourávají se na oxaloacetát, Asp také na fumarát močovinovým cyklem) • Aminokysiny ketogenní: • Leu, Lys (odbourávají se na acetyl-CoA a acetoacetát); • Aminokyseliny gluko i ketogenní: • Trp (odbourává se na acetoacetát a Ala); Phe, Tyr (odbourávají se na fumarát a acetoacetát)

38. Odbourávání aminokyselin na jeden ze sedmi metabolických meziproduktů citrátového cyklu.

39. Ala, Cys, Gly, Ser a Thr se odbourávají na pyruvát. • Ala je transaminován na pyruvát. • Ser je dehydratován serindehydratasou (prosthetická skupina PLP) na aminoakrylát a ten spontánně neenzymově tautomerizuje na iminoderivát, který hydrolyzuje na pyruvát a NH3. • Cys je převáděn na pyruvát různými cestami za odštěpení H2S, SO32- nebo SCN-. • Gly je převáděn na pyruvát přes Ser enzymem serinhydroxymethyltransferasou. Enzym má jako koenzym N ´,N ´-methylen-THF. • Thr je jak glukogenní, tak ketogenní, protože poskytuje pyruvát i acetyl-CoA.

40. Ala, Cys, Gly, Ser a Thr se odbourávají na pyruvát.

41. Ala, Cys, Gly, Ser a Thr se odbourávají na pyruvát.

42. Asp a Asn se odbourávají na oxaloacetát.

43. Asp a Asn se odbourávají na oxaloacetát.

44. Arg, Glu, Gln, His a Pro se odbourávají na Glu a poté na 2-oxoglutarát

45. Ile, Met a Val se odbourávají na sukcinyl-CoA

46. Ile, Met a Val se odbourávají na sukcinyl-CoA.

47. Tetrahydrofolát jako transfer jednouhlíkatých štěpů.

48. Oxidační stupně jednouhlíkatých skupin přenášených THF. • Oxidační stupeň Přenášená skupina THF derivát • Methanol Methyl (-CH3) N 5-methyl-THF • Formaldehyd Methylen (-CH2-) N 5, N 10-methylen-THF • Mravenčany Formyl (-CH=O) N 5 (N10)-formyl-THF • Formimino (-CH=NH) N5 –formimino-THF • Methenyl –CH=) N 5,N 10-methenyl-THF

49. Dva stupně redukce folátu na THF.

50. Tvorba tetrahydrofolátů - jednouhlíkatý štěp.