Marcadores Moleculares

1. Marcadores Moleculares Luis Destefano Beltrán Departamento de Ciencias Biológicas y Fisiológicas Universidad Peruana Cayetano Heredia

2. Marcadores Moleculares Un gen o secuencia de ADN que se puede usar para identificar a un organismo, a una especie, a una cepa o a una característica fenotípica asociada con él Un señal usada en el aislamiento de genes eucarióticos: una sonda de RFLP o un lugar de unión de partidor para amplificación Secuencias de ADN que pueden ser identificadas mediante un simple ensayo: tan pequeño como un SNP o o un frag. de ADN generado por ER’s.

3. Marcadores Moleculares Marcadores moleculares son segmentos o fragmentos de cromosoma que no codifican necesariamente alguna característica, que no están afectados por el ambiente. pero que son heredados de una manera Mendeliana (2006).

4. Isozimas yAlozimas • El “abuelo” de los marcadores moleculares • Lewontin y Hubby, 1966 • - Substituciones de amino acidos cambian • la movilidad de la enzima en el gel: -plegamiento y/o carga • Aún en uso en estudios de Genética de • Poblaciones que necesitan identificar • bajos niveles de variación genética.

6. Isozimas • Pros: • Protocolos bien desarrollados con moderado grado de dificultad. • No se necesita informacion genómica. • Existen décadas y décadas de datos acumulados • (“mining”). • Cons: • Poca variación. • Se necesita abundante tejido fresco. • Loci son una muestra no aleatoria del genoma y muchos estan bajo fuerte selección. • Puede ser considerado un “arte”. • Muchos reactivos químicos peligrosos.

7. Marcadores Moleculares

9. Southern blots • Aislamiento del ADN • Digestión del ADN con enzima de restricción • Separación de los fragmentos de ADN de acuerdo a su tamaño • Denaturación del ADN • Transferencia de las cadenas simples de ADN a la membrana

10. Metodología • Preparación de la sonda • Marcación • Denaturación • Hibridación de la sonda a la membrana • Enjuague de la membrana • Autoradiografía

12. ubicación de los sitios de restricción sonda

13. ADN Anemia Falciforme ADN Anemia Falciforme ADN Normal ADN Normal A B 1. Cortar con MstI 2. Gel A + B ADN β-Globina Normal B A + B A 1. Cortar con MstI 2. Gel ADN Anemia Falciforme Electroforesis en geles de Agarosa Hibrididación Southern

14. SouthernBlot

15. Desventajas • Es tediosa y trabajosa • Puede durar varios días • Costosa • Usa radioisótopos

16. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

17. “PCR is the practice of Biology without a permit”

21. “RAPD allows analysis without a clue”

23. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) • 1990, Welsh & McCleland and Williams et al. • Usa partidores muy cortos (10 pb) para amplificar • fragmentos aleatorios de ADN. • No se necesita ninguna información acerca del • genoma en estudio • Marcador dominante: presente o ausente • Muy desacreditado, pero probablemente no es tan • malo como algunos podrían pensar

24. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

26. Amplified Fragment Length Polymorphism

33. AFLPs • Pros: • Muchos loci estudiados al mismo tiempo • No se necesita ninguna información anterior • Alta variabilidad • Cons: • Homoplasia en el tamaño de los frag’s • Problemas con reproducibilidad • Protocolo es muy largo • Marcador dominante anónimo • Demasiados loci…..!!

34. ADN Repetitivo Microsatélites o Secuencias Simples Repetidas (Simple Sequence Repeats, SSRs) - Mono-, di-, tri-, y tetra-nucleótidos Minisatélites o Short Tandem Repeats (STRs) - 5-10 bp Variable Number of Tandem Repeats - 14-100 bp

35. Microsatélites

40. Rearreglos en los tándem repetidos debido a un crossover desigual

42. Microsatélites • Pros: • -Altamente variable • -Muchos alelos por locus • -Marcador co-dominante • Cons: • -Dinámica evolutiva desconocida • - “Stutter y alelos nulos complican • el “scoring” • -Alta inversión inicial para desarrollar loci

44. Single Nucleotide Polymorphism: SNPs • Pueden representar hasta 90% de la Variación • Genética Humana • 1.5 millon de posiciones presentan variabilidad • Puede ser la base de la susceptibilidad a • enfermedades comunes (cáncer, diabetes, etc) • Farmacogenética: busca identificar la posible • respuesta a las terapias con drogas. • Metodos para identificar depende si es un SNP • desconocido o conocido

49. Marcadores No Polimórficos • STSs (Sequence Tagged Sites) Secuencia corta de ADN (200 – 500 bp) con una ubicación cromosómica conocida que ocurre una vez en el genoma. • ESTs (Expressed Sequence Tags) STSs derived from ADNc’s

50. Conclusiones • Todos los MM’s no son iguales. • Ninguno de ellos son ideales. • Algunos son mejores para algunos propósitos que otros. • Sin embargo, todos son preferibles a los M’s Morfológicos para propósitos de mapeo