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第六章 酶

第六章 酶. 第一节 引言. 一、酶对食品科学的重要性 控制着所有重要的生物大分子的合成、分解 食品加工的主要原料是 生物材料 , 生物材料中含有大量的酶 酶的作用 有益的：皱胃酶、蛋白酶 有害的：果胶酶、脂酶 有效地使用和控制 内源酶 和 外源酶. 酶的定义 酶是具有催化性质的蛋白质，其催化性质源自于它特有的激活能力。 酶的发展简史 1833 年， Payen 和 Persoz 发现麦芽提取液的酒精沉淀物中有一种对热不稳定的物质 ----- 淀粉酶。 19 世纪中期发现了胃蛋白酶、多酚氧化酶、和过氧化物酶。

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第六章 酶

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  1. 第六章 酶

  2. 第一节 引言 一、酶对食品科学的重要性 • 控制着所有重要的生物大分子的合成、分解 • 食品加工的主要原料是生物材料, 生物材料中含有大量的酶 • 酶的作用 • 有益的：皱胃酶、蛋白酶 • 有害的：果胶酶、脂酶 • 有效地使用和控制内源酶和外源酶

  3. 酶的定义 • 酶是具有催化性质的蛋白质，其催化性质源自于它特有的激活能力。 • 酶的发展简史 • 1833年，Payen和Persoz发现麦芽提取液的酒精沉淀物中有一种对热不稳定的物质-----淀粉酶。 • 19世纪中期发现了胃蛋白酶、多酚氧化酶、和过氧化物酶。 • 1894年，德国化学家Emil Fischer发展了酶的特异性（专一性）的概念。

  4. 二、酶的本质 （一）酶是蛋白质 定义（1979年） 酶是具有催化性质的蛋白质，其催化性质源自于它特有的激活能力。 目前 并非都是蛋白质 一些小的核糖核酸分子具有催化能力 食品工业使用的酶都是蛋白质。

  5. protein part - apoenzyme 脱辅基酶蛋白 Holoenzyme 全酶 小分子有机化合物 non protein part - cofactor 金属离子 coenzyme prosthetic group 辅酶 辅基  有些酶不含非蛋白部分，即并非所有的酶均含有Confactor。 完整的活性酶体系包括蛋白质和非蛋白质部分

  6. （二）酶是催化剂(Catalytic activity) • 酶是生物催化剂，其作用是降低反应的活化能（Ea），加速反应的进行，并不影响反应的最终的平衡状态。 • Arrhenius 方程 • Ea: 是动力学考虑的问题，决定反应的速度； • A：频率因子或Arrhenius 因子 • 酶作为催化剂的特点： • 1．用量很少 酶浓度通常在10-8-10-6mol/L。 • 2．效率高 • 酶的周转数 当酶被底物饱和时，在1秒或1分钟内，1mol的活性酶能催化底物周转变成产物的摩尔数。

  7. （三）酶具有特异性（Specificity） • 酶具有不同程度的底物（substrate-specificity）特异性。（一）酶作为催化剂的机制 • 1．Emil Fischer提出的“锁和钥匙”模式 • 在酶的表面存在着一个特殊形状的活性部位，这个活性部位在结构上能与底物精确地互补。底物与酶之间存在某种立体专一结合。底物类似钥匙，酶类似锁。

  8. 2．Koshland的“诱导楔合”（Inducedfit）模型 • 诱导楔合模型要点 • （1）当底物与酶的活性部位结合时，酶蛋白的几何形状有相当大的改变； • （2）催化基团的精确定向对于底物转变成产物是必需的； • （3）底物诱导酶蛋白几何形状的改变使得催化基团能精确地走向和底物结合到酶的活性部位上去。 催化基团 结合基团

  9. 酶的底物特异性 • （1）低特异性（Low specificity） • 不能辨别底物，仅能对裂开的键表现特异性，如非特 • 异性脂酶。 • O •  • O CH2-O-C-R1 •  | • R2-C-O-CH • | • CH2-O-C-R3 •  • O • （2）基团特异性（Group specificity） • 对于相邻于特定基团的一个特殊的化学键表现出特异性。 如胰蛋白酶对羧基一侧为精氨酸和赖氨酸的肽键表现特异性。 • O •  • X-NH-CH-C-NH-CH-COOH (精氨酸或赖氨酸) • | | • R1 R2

  10. （3）绝对特异性（Absolute specificity） • 酶仅作用于一种底物并催化一个反应。例如，脲酶只能催化脲素水解，不能催化甲基脲水解。 • （4）立体化学特异性（Stereochemical specificity） • 通常显示出正确无误和完全的立体定向性，能区别光学或立体异构体。几乎总是选择一对对映体中的一种形式做底物，除非酶的特异功能是催化对映体的异构化。

  11. 三、辅助因子（Cofactors） • 辅酶---维生素的衍生物P197 表6-4 • 与活性部位缔合的除维生素外的小分子有机化合物 • 无机离子，直接参与反应或作为激活剂的金属阳离子或阴离子。P196 表6-3

  12. 习惯命名 α-淀粉酶、纤维素酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、过氧化物酶或过氧化氢酶 • 商品名称 • 系统命名 每一种酶被指定一个由4位数字组成的酶委员会编号（EC number）。 四、 酶的命名 例：聚半乳糖醛酸酶，EC 3.2.1.15 水解酶，糖苷键，O-糖苷

  13. 酶的系统命名的原则

  14. L－抗坏血酸＋1/2 O2 L－脱氢抗坏血酸＋H2O 习惯命名：抗坏血酸氧化酶 系统命名：L－抗坏血酸:氧 氧化还原酶 酶编号：EC 1.10.3.3。

  15. （一） 氧化还原酶类 • 催化底物的氧化还原，反应时需要电子的供体和受体。 • AH2＋ B === A＋BH2 • AH：供氢体， B：受氢体。 • 根据供氢体的性质，又可分成氧化酶类和脱氢酶类。 • 1．氧化酶类 • 按照生成产物是H2O还是H2O2，又可分成两小类。 • 在生成H2O2的反应中，一般需要FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）或FMN（黄素单核苷）为辅基。 • 作用时，底物脱下的氢先交给FAD形成FAD·2H然后FAD·2H与氧作用，生成H2O2，放出FAD。

  16. 如葡萄糖氧化酶 2．脱氢酶类 催化从底物上直接脱氢，例如醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶。

  17. （二）转移酶类 催化一种分子上的基团转移到另一种分子上。 A－R＋B ==== A＋B－R R为被转移基团，可以是一个很小的基团，也可以是一个糖残基甚至一条多糖键。 此类反应的底物有两个：一个是供体，一个是受体。 • （三）水解酶类 • 催化大分子物质加水分解为小分子物质。 • A－B ＋ H OH ==== A OH ＋BH • 大都属于胞外酶，在生物体内分布最广，数量也最丰，应 用最广泛。 • 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、核糖核酸酶及纤维素酶等。

  18. （四）裂解酶类 催化一个化合物分解为几个化合物或逆反应。 A－B ==== A ＋ B （五）异构酶类 催化底物的分子内重排反应。如，葡萄糖异构酶。 葡萄糖 ==== 果糖 （六）合成酶类 将两个底物分子合成为1个分子，反应时，由ATP或其他高能的核苷三磷酸提供反应所需的能量。 A ＋ B ＋ ATP ==== AB ＋ ADP（或AMP） ＋ 无机磷酸 （或焦磷酸）

  19. 第二节 酶在食品材料中的分布 • 1．酶的分布 • （1） 酶在食品材料中的分布是定位化或区域化分布的。 • 细胞中大多数的酶与亚细胞器的膜结合。 • （2）一种酶往往仅存在于细胞的一类细胞器。 • 细胞核 主要涉及到核酸的生物合成和水解降解。 • 线粒体 含有与氧化磷酸化和生成ATP有关的氧化还原酶。 • 溶菌体和胰酶原颗粒 主要含有水解酶。 • （3）特定的器官含有特定种类的酶。 • 动物胃肠道 主要含水解碳水化合物、脂、蛋白质和核酸酶。 • 种子含有相当数量的水解

  20. 2. 酶的隔离分布和与底物的接近 • 酶与底物接近会导致食品的色泽、质构、风味、芳香和营养质量上的改变。 • 3. 酶在食品原料中的含量 • 不同食品原料找能够含有的酶的种类和数量不同。 • 同一种酶在同一种食品原料中的含量还与生物体的年龄（成熟度）和生长的环境条件。

  21. 第三节 酶的纯化和测定 • 一、酶的纯化（Purification) 食品级酶制剂必须符合食品法规，但不是纯酶，含有其它酶组分和非酶组分。 酶的分离纯化技术包括： • 选择性沉淀（高浓度盐或有机溶剂） • 膜分离 • 层析技术（凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱）等。

  22. 二、酶活的测定（Activity Assay) • 1. 测定酶活力的方法： • （1）通过定量测定酶反应的产物或底物的变化。 • （2）通过定量测定酶反应底物中某一性质的变化，如粘度等。 • 酶活定义：在一定条件下，催化单位底物转变成产物所需的酶量。 • 酶活单位 • U：国际生物化学协会酶委员会定义：每分钟催化1μmol底物发生转变的酶量，即：1μmol/min。 • kat：酶活力的SI单位，即Katal。Katal的定义是每秒钟催化1 mol底物发生转变的酶量，即：1mol/s 。 • 1 kat=6×107 U 1 U=1.67×10-8 kat • 商业上，根据需要

  23. 2．酶活力测定方法： • 通常在酶的最适pH和离子强度以及指定的温度下测定酶活。 • 直接测定酶活(direct assay) • 测定酶作用于底物的速度来确定酶的活力,测定产物的形成速度 • 产物量 • 时间 • 当[E。]远远小于[S。]时 v=Vmax=k3[E。], v与[E。]成正比。 • 初速度 • 酶浓度 不同酶浓度下产物量随时间的变化 初速度随酶浓度的变化

  24. 酶活测定必须满足的条件： • （1）产物的量与时间呈线性关系 即要测初速度。 • （2）反应速度与酶量呈线性关系 即要满足[S。]远远大于Km(至少大于20倍)。 • 报道酶活应该写明： • 酶活测定的条件，定义。 • 比酶活，一般是酶活 U/mg蛋白质。 • 单点测定（Single-point assay） 必须保证产物的浓度与反应时间在0-t1段呈线性关系。 • 淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶几乎无一例外。

  25. 第四节 酶反应动力学 E: 游离状态酶； S: 底物； ES: 酶-底物络合物 P: 反应产物； K: 反应速度常数 反应速度：v=d[p]/dt 动力学：v[S]

  26. 一、酶催化反应动力学 （单底物酶反应动力学） 1902年Henri • 反应速度v和底物浓度[S]的关系非线性

  27. Michaelis-Menton Equation Km：Michaelis 常数，米氏常数。 Vmax： 最大反应速度，所有的酶都以ES形式存在，及酶被底物饱和。

  28. 米氏方程的推导 快速平衡假定: (1) 反应速度为初速度， [S]消耗仅占[S]0的5％以内，产物生成极少，(E+P)的逆转可以忽略不计。 (2) [S]大大高于 [E]，[ES]的形成不会明显降低 [S]。 (3) ES解离成(E＋S)的速度也大大超过ES分解形成(P＋E)的速度，E+S ES的可逆反应在测定初始速度υ的时间内已达到动态平衡，少量P的生成不影响这个平衡， 稳定态假定

  29. 双曲线特征 • 当[S]远远小于Km时 • 一级反应动力学 • 当[S]远远大于Km时 • 零级反应动力学 vmax的意义：在最适条件和被底物饱和时的理论上的最大反应速度。 • 其他情况介于一级和零级之间

  30. Km的意义 • 当v=vmax/2时，Km=[S] • 即Km为当酶反应速度达到最高反应速度一半时的底物浓度。 Km指示酶与底物的亲和力。 Km较低，亲和力高，催化效率高。

  31. Km和Vmax的测定 米氏方程两边取倒数得： 截距=1/vmax 斜率=Km/ vmax

  32. 二、酶的抑制动力学 • 抑制剂：能抑制甚至阻止酶催化反应进行的物质。 • 无机物：强酸、强碱、重金属离子（Hg2+、Pb2+或Ag+）、一氧化碳、硫化氢等， • 有机化合物：某些有机碱、染料、EDTA、SDS、脲或酶催化反应的自身产物等。 • 抑制作用有可逆性抑制和不可逆性抑制。

  33. 1．不可逆抑制 • 抑制剂一旦与酶结合，再也不能用透析或稀释等方法将其除去，酶的催化活力永久性丧失。 • 一般都抑制剂与酶的活性中心基团结合。例如，重金属离子、碘乙酸等与酶活性中心的－SH结合，有机磷化物与酶活性中心的丝氨酸残基上的－OH结合。

  34. 2．可逆抑制 • 通过透析或凝胶过滤色谱可是使抑制剂－酶络合物离解和使酶活力复原； • 四类可逆： • Lineweaver-Burk方程在存在抑制剂和不存在抑制剂时的差别仅表现在斜率和/或截距上。 (a) 竞争性； (b) 非竞争性； (c) 反竞争性 (d) 变构抑制剂。

  35. （一） 竞争性抑制（competitive inhibition） 抑制剂与底物竞争与酶反应 E + S ES E + P KIEE + I EI KIE:酶-抑制剂络合物离解常数 Km变大，但Vmax不变

  36. （二）  反竞争性抑制（uncompetitive inhibition） 抑制剂与ES作用而不是与E作用 E + S=== ES +I=== ESI E + P ESI: 酶-底物-抑制剂络合物 Km 和Vmax均变小 KIE:酶-抑制剂络合物离解常数

  37. （三） 非竞争性抑制 （noncompetitive inhibition） 抑制剂与E和ES均作用 E +S === ES === P + E + + I I ‖ ‖ EI ESI 当KIE=KESI时 简单的非竞争抑制 Km不变，Vmax变小 KEI:酶-抑制剂络合物的离解常数

  38. 不同类型的可逆酶抑制的特征：

  39. 第五节 影响酶活力的环境因素 （Factors influencing enzyme activity） • 内在因素 • 酶的浓度 • 底物的浓度 • 环境条件 • pH • 温度 • 水分活度 • 抑制剂

  40. 酶浓度 当[E]＜＜[S]， 反应速度∝酶浓度 酶浓度对反应速度的影响

  41. 一、温度对酶反应的影响 1.温度对酶活力的影响 测定方法：在不同温度下测定酶活。

  42. 2. 酶的热稳定性 测定方法：酶液置于不同温度下保温一定时间后，在同一条件下测定酶活。

  43. 3.酶反应最适温度 1.最适温度是操作参数 （1）温度较低时，提高温度反应速度提高。 （2）温度较高时，酶会热失活。

  44. 4. 酶失活动力学 • 遵循一级动力学 • 根据lg[EN]对t作图，直线的斜率为- k/2.303, 以此可求出k。

  45. Arrnenius方程 • Ea：酶热变性的活化能 • R：通用气体常数 • lgk－1/T 呈线性关系 • 直线的斜率为

  46. 活化能高表示反应速度随温度的提高很快提高。活化能高表示反应速度随温度的提高很快提高。 • 降低活化能，产生两个效果 • 低温下，使高比例的反应物转变成产物。 • 升高温度对酶反应速度造成的影响相对较小。 • 在酶稳定的范围内，尽可能采用高温。

  47. 酶在高温下会失活，在低温下也会失活。但酶在低温下一般为可逆失活的失活酶在高温下会失活，在低温下也会失活。但酶在低温下一般为可逆失活的失活 • 酶在低温下失活可归因于蛋白质的展开，如果酶有四级结构，也可归因于亚基的解离。

  48. 5.低温下酶的作用 （1）食品原料部分冻结（0℃以下）时，酶的活动并没有完全停止。 （2）“冻结”或“固体状态” 是指整个体系的外型，并不是酶所处的状态。 （3）冻结时，体系的一部分水 固相，提高了溶质在冻结液相的度。 （4）在通常的食品的冻结温度下，总还是有足够的液体水分子使酶能继续作用。

  49. 试样在低于其冰点的一定温度范围内部分冻结后，酶的活力有可能提高，也可能降低。 • 应避免稍低于冰点的温度保藏食品，因为： • 水冻结后，酶和底物浓缩，促进酶活 • 冻结和解冻破坏组织结构，酶容易接近底物

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