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ADN recombinante

ADN recombinante. Dr. Luis A. Mora B. Cátedra de Bioquímica UCIMED. IMPORTANCIA BIOMÉDICA. Diagnóstico Medicina forense Terapia génica Producción de medicamentos insulina factores de la coagulación activador del plasminógeno hormona de crecimiento Producción de vacunas

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ADN recombinante

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Presentation Transcript

  1. ADN recombinante Dr. Luis A. Mora B. Cátedra de Bioquímica UCIMED

  2. IMPORTANCIA BIOMÉDICA • Diagnóstico • Medicina forense • Terapia génica • Producción de medicamentos insulina factores de la coagulación activador del plasminógeno hormona de crecimiento • Producción de vacunas Antihepatitis B

  3. IMPORTANCIA BIOMÉDICA • Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios en la secuencia de ADN. • Identificación de las bases moleculares de la enfermedad • Hipercolesterolemia Familiar • Drepanocitosis • Talasemias • Fibrosis Quística • Distrofia Muscular

  4. ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN • Forma • Componentes • Apareamiento de las bases • Pares de bases en genoma haploide humano. 3x109 • Longitud de genes. 3x103 • Empacamiento del ADN

  5. EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN • Replicación • Transcripción (Exones e intrones) • Traducción • Síntesis de proteínas

  6. TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE • Aislamiento del ADN • Desnaturalización • Manipulación Endonucleasas Polimerasas • Formación de moléculas quiméricas

  7. TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

  8. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN • También conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia de nucleótidos que reconocen (diana de restricción ) ; estos tienen entre 4 y 12 pb. • Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina. E. coli. Insulina humana. • Las mismas permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones). Esto produce dos extremos: romos y cohesivos o escalonados. Estos pueden unirse por ligasas. • ADN vector: capaz de replicarse independientemente del de la célula anfitriona: plásmidos. •  De organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. No pueden cortar ADN metilado. • Isoesquizómeros: distintas, de diferentes especies, idéntica diana , dejan el mismo extremo cohesivo pero no cortan en el mismo sitio.

  9. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Tipo 1: Restricción (cortan) y modificación (metilan).Al reconocer cortan al azar en sitios distintos , ya sea corriente arriba o abajo, dejan extremos cohesivos. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte (unas 1000 pb), S adenosil metionina (SAM) y Mg +2 como cofactores.  Tipo 2: Sólo restricción. Otras enzimas metilan.Cortan de manera consistente y predecible en el sitio que reconocen o muy cerca de él. Por ello son muy utilizadas en clonación, pues se pueden recuperar secuencias conocidas.Sólo requieren Mg++ como cofactor.No necesitan ATP. Tipo 3 : Restricción y modificación. Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades. Cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento de orientación opuesta en la misma cadena de ADN. Necesitan ATP, Mg y SAM.

  10. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Nomenclatura  Se asigna según el origen bacteriano. Consiste en: 1)Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo: Escherichia coli (Eco) 2) La cepa o estirpe si la hubiere. ( EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli ) 3) En números romanos para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de una misma especie. No confundir con el tipo o clase de enzima. 4) Todas deberían llevar delante una R de restricción o M de metilasa según la función pero usualmente se omite.

  11. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes: 1. Cohesivos o pegajosos: GAATTC GGATCC AAGCTT CTTAAG CCTAGG AACGAA EcoRI BamHI HindIII 2.  Abruptos: AATATT CCCGGG TTATAA GGGCCC SspI SmaI

  12. TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE • Definición • Vectores Plásmidos bacterianos ADN circular de doble banda Inserción de 6-10 Kb Fagos virales ADN lineal de doble banda inserción de 10-20 Kb Cósmidos Son plásmidos con características de fagos ADN circular de doble banda inserción de 35-60 Kb YAC Son cromosomas artificiales de levaduras

  13. TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE Propiedades de los vectores • Replicaciones independientes del ADN de la célula hospedera • Secuencias de ADN conocidas • Copias únicas • Cromosoma más pequeño que el del hospedero

  14. TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

  15. TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

  16. CLONACIÓN • Definición: • m. Biol. Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos, originado por reproducción asexual a partir de una única célula u organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales. • m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico obtenidos a partir de una misma secuencia original.

  17. CLONACIÓN

  18. Gracias

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