Huella Gen é tica o “Fingerprinting” Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

1. Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa) Huella Genética o “Fingerprinting” Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

2. Huella genética o “Fingerprinting” de ADNTemas Cubiertos • Digestión de las muestras de ADN con enzimas de restricción • Introducción a la base teórica de Huella Genética o “Fingerprinting” de ADN • Electroforesis de geles de agarosa • Análisis e interpretaciones de los resultados

3. Aplicaciones al mundo real deHuella genética o “Fingerprinting”de ADN • Escena del crimen • Relación entre humanos • Paternidad • Relación entre animales • Estudios antropológicos • Estudios de organismos que causan enfermedades • Identificación de alimentos • Restos Humanos • Monitoreo de transplantes

4. El kit de Huella genética o “Fingerprinting” de ADN Forense Puede ayudar a enseñar: • La estructura de ADN • Análisis de patrones de restricción de ADN • Electroforesis en gel de agarosa • Determinación de tamaño • Simulación de “Fingerprinting” de ADN forense real

5. Huella GenéticaResumen de los Procedimientos

6. Huella GenéticaProcedimiento Primera Parte

7. Huella GenéticaProcedimiento Segunda Parte

8. Huella GenéticaProcedimiento Tercera Parte

9. Equipo de Electroforesis de AgarosaBio-Rad • Cubetas de Electroforesis • Fuentes de Electricidad • Geles de agarosa preparados PowerPac™ Junior PowerPac™ Basic PowerPac™ HC PowerPac™ Universal PowerPac™ 3000 Mini-Sub® Cell GT Wide Mini-Sub Cell GT

10. Los Cromosomas están Compuestos de ADN y Proteínas llamadas Histonas.

11. El Estudio de CariotipoAyuda a Identificar Anormalidades Genéticas

12. El ADN existe enrollado apretadamente alrededor de proteínas llamadas Histonas, formando estructuras denominadas cromosomas que se encuentran en el núcleo.

13. Modelo del ADNEl ADN está compuesto de:fosfatos,azúcares de cinco carbonos llamadas deoxirribosas,y cuatro tipos de bases nitrogenadas(adenina, timina, citosina, guanina).

14. Ácido Desoxirribonucleico(ADN)

15. O O P O Base O O CH2 Azúcar O O P O Base O O CH2 Azúcar OH 5’ fosfato ADNRepresentación Esquemática Sólo se muestra una cadena de ADN. 3’ hidróxido

16. Los Genes consisten de exones y de intrones.Los exones son secuencias de ADN que se expresan en la célula.Los intrones son secuencias de ADN que no se expresan en la célula.

17. Los Intrones son removidos del ARN durante el proceso de Transcripción

18. Enzimas de Restricción -Enzimasque cortanADN virus • Evolucionadas por bacterias para protegerse contra infecciones virales. • Son endonucleasas, cortan en el interior de las hebras del ADN. • Se conocen más de 3,000 enzimas de restricción. bacteria

19. Sitio de Reconocimiento de la Enzima de Restricción Sitio de restricción Secuencia Palindrómica • Cada enzima digiere (corta) ADN en una secuencia específica, o sitio de restricción. • Las enzimas reconocen de 4 a 6 pares de bases organizadas en secuencias palindrómicas (Ej. GAATTC). Fragmento 1 Fragmento 2

20. Extremos Sobresalientes5’ o 3’ La enzima corta aquí • Algunas enzimas de restricción generan extremos sobresalientes 5’ (cinco primo), como la mostrada aquí. • Otras enzimas de restricción generan extremos sobresalientes 3’ (tres primo).

21. Enzimas deRestricción Comunes EcoRI – Eschericha coli – Extremos Sobresalientes 5’ • • EcoRI – Enzima de restricción que genera extremos sobresalientes 5’. • PstI – Enzima de restricción que genera extremos sobresalientes 3’. Pstl – Providencia stuartii – Extremos Sobresalientes 3’

22. Extremos Parejos AluI – Arthrobacter luteus – Extremos Parejos • • Existen otras enzimas de restricción que generan extremos parejos; • es decir, extremos que no tienen porciones sobresalientes. • Ejemplos: • AluI y HaeIII HaeIII – Haemophilus aegyptius – Extremos Parejos

23. Otros Componentes en la Reacción de la Digestióndel ADN • Búfer Restricción permite las condiciones óptimas para la reacción • NaCI proporciona la concentración correcta de iónes • Tris-HCI proporciona el pH correcto • Mg2+ es un co-factor enzimático

24. Temperatura de la Digestióndel ADN ¿Por qué incubamos a 37°C? • La temperatura del cuerpo es la temperatura óptima para éstas y otras enzimas. ¿Qué pasa si la temperatura de la reacción es demasiado fría o demasiado caliente? • Muy caliente: la enzima puede ser desnaturalizada. • Muy fría: la actividad de la enzima puede ser más lenta, requiriendo más tiempo para digerir el ADN.

27. Las muestras de ADN digeridas se guardarán en la nevera para ser analizadas el día siguiente.

28. Asegúrese de que los pozos están en el lado del polo (-).

30. Electroforesisen Agarosa: aplicando las muestras • Corriente Eléctrica La corriente mueve el ADN, que tiene una carga negativa, hacia el electrodo positivo (+, rojo). Búfer Tinta Gel de agarosa Fuente de Poder

31. Electroforesisen Agarosa:corriendo las muestras • La gel deagarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño. Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes. Corriendo la Gel Fuente de Electricidad

33. Electroforesisen Agarosa:resultados típicos • La gel deagarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño. Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes.

34. Análisis de la Gel Teñida Determine los tamaños de los fragmentos de restricción. • Cree una curva estándar utilizando un marcador de ADN. • Mida la distancia (en mm) recorrida por los fragmentos de restricción. • Determine los tamaños de lo fragmentos de ADN. Identifique la relación entre las muestras.

35. Determinación del Tamaño Molecular Curva Estándar de “Fingerprinting”: Semilogritmico 100,000 Tamaño (pb) Distancia (mm) 23,000 11.0 9,400 13.0 6,500 15.0 4,400 18.0 2,300 23.0 2,000 24.0 pb = pares de bases mm = milímetros 10,000 Tamaño (pares de baes) B 1,000 100 A 0 5 10 15 20 25 30 Distancia (mm)

36. “Fingerprinting” de ADN Extensiones a la práctica de laboratorio • Estudios Independientes • Aislamiento del plásmido de (mini-preps) • La cartografía de un plásmido utilizando las enzimas de restricción • Análisis por “Southern blot” • Prácticas de introducción a la electroforesis: Kool-Aid/FastBlast Indicador de pH en un búfer