Gustavo Garcia Luiz Gustavo Gardinassi Thais Herrero

1. pDCs play off scratch Gustavo Garcia Luiz Gustavo Gardinassi Thais Herrero

2. Modelo de desenvolvimento das células dendríticas

3. Função das células dendríticas

4. Subpopulações de Células Dendríticas CD45+

5. LC- células de Langerhans IDEC- células dendríticas epidermal inflamadas. PDC- células dendríticas plasmocitóides CD123- cadeia alfa do receptor da IL-3

6. J. Exp. Med- September 17, 2001 RT-PCR

7. Importância da produção dos IFNs do tipo 1 Nature Reviews Immunology 8, 259-268 (April 2008)

8. pDC são população de células circulantes • Ausentes na pele normal, porém migram para pele inflamada • Expressam TLR7 e TLR9 • Produz grande quantidade de interferons tipo 1

9. LL37/CRAMP- peptídeo antimicrobiano catelicidina

11. Controle da infecção/lesão Autoimunidade

13. Objetivo: Avaliar o papel das células dendríticasplasmocitóides (pDCs) durante a lesão da pele e no processo de cicatrização

14. Derme Quantificação das células dérmicas Digestão com 1mg/ml de colagenase por 2h Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs?

15. Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs? Assim,  lesões na pele induz uma infiltração rápida e robusta de pDCs paralela à infiltração por neutrófilos no local da lesão.

16. Análise da expressão gênica por Real-time PCR Pele total (0, 6, 24, 48 e 72h) Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I? As pDCs são a principal fonte de IFN-α/β na lesão, enquanto as citocinas inflamatórias IL-6 e TNF são produzidas por outros tipos celulares que não as pDCs.

17. 48hs 48hs 2 Acs (PDCA1 e mAb 927) ou IgG como controle antes da lesão Acs (anti-Ly6C) ou IgG como controle antes da lesão 24hs 24hs Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I? 24h Demonstrando que a pele danificada induz uma rápida infiltração e ativação de pDCs.

18. MyD88 -/- Análise da expressão gênica por Real-time PCR Pele total (24h) Lesão IRS 954 (0, 1, 10 ou 100μg) Análise da expressão gênica por real-time PCR Pele total (24h) Lesão Os TLRs estariam envolvidos na ativação pDCs e produção de INF-α/β?

19. pDCs do baço • DNA • CRAMP • CRAMP+DNA • scCRAMP+DNA • scCRAMP Overnight Análise da expressão de catelecidina (CRAMP) por Real-time PCR Pele total (0, 6, 24, 48 e 72h) As catelicidinas são induzidas neste modelo de injúria de pele? ELISA Sugere-se um potencial papel das catelicidinas na quebra da tolerância inata para ácidos nucléicos próprios.

20. As catelicidinas estariam também envolvidas com a quebra da tolerância inata contra ácidos nucléicos in vivo? • FACs • Real-time PCR CRAMP scCRAMP Salina Pele total (0, 24 e 48h) Sim, CRAMP é suficiente para quebrar a tolerância inata e induzir a ativação de pDCs e produção de IFNs na pele in vivo.

21. As catelicidinas são necessárias para a ativação das pDCs na pele danificada? CRAMP -/- Análise da expressão gênica por Real-time PCR Com ou sem lesão Pele total (24h) Assim, as cetelicidinas são suficientes, mas não necessárias para a quebra da tolerância inata a ácidos nucléicos e induz a produção de IFN-α/β pelas pDCs na pele danificada.

22. 2 Acs (PDCA1 e mAb 927) ou IgG como controle antes da lesão Estes resultados demonstram que as pDCs infiltrantes, desenvolvem um papel importante na indução da resposta imune inflamatória na pele danificada, e em particular a indução de IL-6 e citocinas Th17 As pDCs induzem uma resposta inflamatória na pele danificada? Citocinas inflamatórias por Real-time PCR Com ou sem lesão Pele total (24h)

23. As pDCs teriam um papel na reepitelização da pele danificada? Análise da expressão de Keratina 6 (K6) Pele com lesão Imunofluorescência Estes resultados indicam que a infiltração das pDCs na pele danificada desenvolvem um papel importante na pele danificada promovendo uma rápida reepitelização da lesão.

24. IFNAR -/- Qual seria o papel dos IFN-α/β neste processo? Quantificação da Keratina 6 (K6) e análise da expressão das citocinas inflamatórias por Real-time PCR Pele com lesão Estes resultados sugerem que a capacidade das pDCs dispararem uma rápida resposta inflamatória e promoverem o reparo do tecido esta relacionado a ativação dos TLR mediada por ácidos nucléicos e produção de IFN-α/β.

25. E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade? 7 voluntários Imunoistoquímica para BDCA2 (marcador específico de pDCs humana) e Real-time PCR Biópsias antes e 24h depois da lesão • Fita adesiva Sim, similar aos resultados obtido no modelo murino, as pDCs foram ativadas e produziram IFN-α na pele danificada.

26. E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade? 7 voluntários Imunoistoquímica para BDCA2 (marcador específico de pDCs humana) Biópsias antes e 24h depois da lesão • Lauril sulfato de sódio (SLS) Assim como no modelo de lesão mecânica, o modelo de lesão química induziu uma rápida infiltração de pDCs e uma significante indução da expressão de mRNA de IFN-α na pele danificada.

27. Conclusão Controle da infecção/reparo tecidual

28. Objetivo: Investigar o papel das pDCsnainflamçãodapele de indivíduossuscetíveis a doençaautoimune

29. Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos? Linhagem 129 24h Tape stripping Citometria de fluxo

30. Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos? Linhagem 129 24h Tape stripping Imunomarcação Após a inflamção, pDCs e neutrófilosinfiltram-se napele, ondepDCsproduzem IFN- e neutrófilosproduzem NETs.

31. Os IFN tipo I atuamnaindução de genes pró-inflamatóriosnapelelesionada? INFAR-/- ou WT 24h Naive/Tape stripping Real Time PCR

32. A indução de genes pró-inflamatóriosnapelelesionadaenvolve a sinalização via TLR? MyD88-/- ou WT 24h Naive/Tape stripping Real Time PCR O requerimento de MyD88 naindução de genes pró-inflamatóriosdemonstra um importantepapeldasinalização via TLR.

33. Os TLR7 e TLR9 estãoenvolvidosnaindução de genes pró-inflamatóriosnapelelesionada? IRS 954 24h Naive/Tape stripping Real Time PCR Sim, a sinalização via TLR 7 e TLR 9 é necessáriaparamudançasnaexpressão de genes pró-inflamatóriosnapeledanificada.

34. pDC e Neutrófilossãonecessáriospara a indução de genes pró-inflamatóriosnapelelesionada? 24h Anti-120G8 Anti-GR1-Ly-6G WT Naive/Tape stripping Real Time PCR pDC e Neutrófilossãorequeridospara a indução de genes pró-inflamatórios, porémpromovemrespostasinflamatóriasdiferentes.

35. Quais as característicasdarespostainflamatória de (NZBXNZW)F1napelelesionada? 1, 4, 20d (NZBxNZW)F1 C57/BL6 129 Real Time PCR Quant. Lesão aberta Histologia Tape stripping

36. Quais as característicasdarespostainflamatória de (NZBXNZW)F1napelelesionada? Após a inflamação, (NZBXNZW)F1 desenvolvemlesõescrônicasnapele, semelhantes a lesõesobservadasem CLE de humanos.

37. pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 sãorequeridasparainiciar e manterlesõescutâneas? (NZBxNZW)F1 15-23d Quant. Lesão aberta Anti-120G8 ou IRS 954 Tape stripping

38. pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 sãorequeridasparainiciar e manterlesõescutâneas? (NZBxNZW)F1 4d 15-23d Quant. Lesão aberta Histologia IRS 954 Tape stripping As pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 sãorequeridas, pois a depleção de pDC e a inibição dos receptorestanto antes, quantodurante a inflamação, resultamemumamelhoradacicatrização.

39. Conclusão ? Controle da infecção/reparo tecidual Autoimunidade Exacerbação da lesão Doença