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Proteínas Recombinantes

Proteínas Recombinantes. Histórico e vantagens. Origem. 1944 - Oswald Avery : transmissão de informações pelo DNA. 1961- François Jacob e Jacques Monod: síntese proteica apartir do DNA. 1972- Paul Berg: Ligação de cadeias genéticas de animais organismos diferentes.

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Proteínas Recombinantes

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Presentation Transcript

  1. Proteínas Recombinantes Histórico e vantagens

  2. Origem • 1944 - Oswald Avery: transmissão de informações pelo DNA. • 1961- François Jacob e Jacques Monod: síntese proteica apartir do DNA. • 1972- Paul Berg: Ligação de cadeias genéticas de animais organismos diferentes. • 1978- Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton Smith: Enzimas de restrição (Nobel)

  3. Sistemas de Expressão

  4. Sistemas de Expressão Desvantagem: Produz muitas proteases!!

  5. Sistemas de Expressão

  6. Sistemas de Expressão

  7. Sistemas de Expressão

  8. Impacto das P.Rs no desenvolvimento de vacinas 17 vacinas em 137 anos. 31 vacinas em 40 anos

  9. Objetivo: • Estabelecer uma abordagem eficiente frente a proteínas de difícil expressão utilizando E.coli. • Para estabelecer uma estratégia 71 proteínas foram escolhidas e cada uma expressa em 15 formas diferentes: (cepa x temperatura x plasmídeos x estresse)

  10. Cepas de E.coli • BL21-Gold: deficiente em EndA1 nuclease • BL21-Codon plus: obtida da BL21 Gold, apresenta mais copias de genes que codificam tRNAs. • BL21-V2R1: Derivadas de cepas BL21 deficientes em lon (deficiente em proteases dependentes de ATP) de e omT (deficiente em proteases de membrana). • BL21-V2R1 pRARE2: introdução do plasmídeo pRARE2 que fornece tRNAs. • BL21-Rosetta: códons raros, deficiente em protease e resistente a cloranfenicol. • ArcticExpress: contém chaperonas que auxiliam no folding e possibilitam o funcionamento metabólico de 4° a 12°C. • JM109: mutações em EndA1 e RecA1, indicado para clonagem de plasmídeos. • W3110: mutação no gene gatA que responsável pela metabolização do C.

  11. Plasmídeos 6 His-tags introduzidas em C-terminal ou N-terminal.

  12. Purificação • Os lisados e sobrenadantes são incubados com beads NI-NTA. • A avaliação da expressão é feita por SDS-PAGE.

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