1 / 73

Oversikt

Oversikt. RNA polymerase I proteinfaktorer og promoter/gen-organisering RNA polymerase III proteinfaktorer og promoter/gen-organisering RNA polymerase II proteinfaktorer og promoter/gen-organisering Kromatin som medspiller. 80% av total RNA syntese fra disse ”Oddpols”.

december
Télécharger la présentation

Oversikt

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Oversikt • RNA polymerase I • proteinfaktorer og promoter/gen-organisering • RNA polymerase III • proteinfaktorer og promoter/gen-organisering • RNA polymerase II • proteinfaktorer og promoter/gen-organisering • Kromatin som medspiller 80% av total RNA syntese fra disse ”Oddpols”

  2. RNA polymerase I (RNAPI)

  3. Klasse I gener (rRNA) transkribert avRNA polymerase I (RNAPI) • RNAPI syntetiserer kun en type RNA: ribosomalt RNA • En transkripsjonsenhet (7.5 kB) • Multiple tandem-gener for å øke rRNA-produksjonen • 50 - 10 000 genkopier avhengig av art

  4. Nucleoli • RNAPI lokalisert til nucleoli (ribosom-fabrikker)

  5. UPE Core Enhancere Terminator elementer Klasse I gener (rRNA):promoter-organisering • Repeterte gener med promotere imellom • Intergenisk spacer (IGS) med terminator+promoter

  6. UPE Core Enhancere Terminator elementer Klasse I gener (rRNA):Hjelpefaktorer involvert • Repeterte gener med promotere imellom • Intergenisk spacer (IGS) med terminator+promoter UBF UBF SL1 TTF-1 RNAPI

  7. RNA polymerase III (RNAPIII)

  8. Klasse III-gener transkribert avRNA polymerase III • RNAPIII syntetiserer et fåtall ulike RNA som er små, stabile og ikke-translaterte • tRNA, 5S rRNA, 7SL RNA, U6 snRNA ++

  9. Promotere - tre typer • Typer promotere • Type I: som i 5S rRNA genet, A-I-C blokker • Type II: som i tRNA genene, A+B blokker • Type III: atypiske uten intrageniske elementer A I C +1 +50 +64 +80 +97 +120 A B +1 +8 +19 +52 +62 +73

  10. Klasse III gener transkribert avRNA polymerase III • Promotere med intrageniske elementer • Mutasjoner endrer både promoter og produkt • Polymerasen må lese igjennom aktiverende transkripsjonskomplekser A-blokk B-blokk

  11. Klasse III gener: hjelpefaktorer som deltar • Type II promotere - mest klassiske • Sekvens: TFIIIC - TFIIIB/TBP - RNAPIII RNAPIII TFIIIC A B TFIIIB TBP

  12. Klasse III gener: hjelpefaktorer som deltar • Type I promotere • en type gen, en spesial faktor TFIIIA • Sekvens: TFIIIA - TFIIIC - TFIIIB/TBP - RNAPIII RNAPIII TFIIIC TFIIIA A I C TFIIIB TBP

  13. RNA polymerase II (RNAPII)

  14. Understanding transcription - Increasing complexity 80ties 70ties 90ties Today Lemon and Tjian 2000 Genes Dev. 14:2551-69

  15. Klasse II-gener transkribert avRNA polymerase II Mediator Signal RD RNAPII TF TAD TFIID DBD Transcription factors TBP Chromatin GTFs TATA Enhancer Promoter Nucleosomal template - chromatin modifying activities

  16. Språket: cis-elementene

  17. cis-elementenes funksjon = Templater for kompleksdannelse • The function of cis-elements is being templates for the assembly of multiprotein complexes

  18. core promoter • oppstrøms regulatoriske element • Enhancere • Boundary elements • LCR - locus control regions Promoter- organisering

  19. Klasse II gener transkribert avRNA polymerase II • Subklasser av RNAPII-promotere • mRNA-kodende • TATA+ • INR+ • både TATA og INR • uten TATA, uten INR • snRNA-kodende

  20. Noen typer cis-elementer • UPE - Upstream promoter elementer • Binder konstitutivt uttrykte faktorer som finnes i alle celler • Lokalisert nær TATA/INR (innen ca. 200 bp) • Eksempler • CCAAT boks - binder ulike TFs (CTF/NF-I, CBFINF-Y) • GC-rike bokser - binder Sp1 • Regulatoriske elementer • 1. Responsive elementer • eks.: CRE, HSE, GRE - medierer respons overfor cAMP, heat shock, glucocorticoider • 2. Celletypespesifikke elementer • Lokalisert innblandet med UPE

  21. Enhancere • Distale elementer - Enhancere • Øker kraftig aktiviteten av en promoter • virker over lang avstand, uavh. av orientering, upstream/downstream • Drosophila wing margin enhancer: 85 kb upstream TSS • Immunoglobulin Hm enhancer: i 2. Intron • T-cell receptor a-chain enhancer: 69 kb downstream • samme cis-elementer som proksimalt • multiple cis-elementer innen et lite område (50 bp - 1.5 kb) • cis-elementer for mange ulike faktorer • responsive/vevsspesifikke avhengig av sammensetning

  22. Mediator Signal RNAPII TF TFIID TBP Chromatin GTFs TATA Klasse II gener transkribert avRNA polymerase II

  23. Prokaryot  RNA polymerase II  ´  Eukaryot DNA-bindende • Core med aktivt sete • RPB1 (´-like)binder DNA • RPB2 (-like) binder NTP • RPB3 (-like) assembly factor • Felles subenheter • RPB5, 6 og 8 felles for RNAPI-III • Til forskjell fra prokaryot RNAP, er RNAPII ikke i stand til spesifikk promoter-gjenkjenning NTP-binding

  24. CTD - ”C-terminal domain” • Hale på største subenhet: (YSPTSPS)n • n = 26 i gjær, 52 human pol.II • hydrofil eksponert hale • Unik for RNAPII • Essensiell funksjon in vivo •  >50% letalt

  25. CTD- funksjon • Fosforylering: (YSPTSPS)n • Reversibel fosforylering på både Ser og Tyr • Fosforylering endres gjennom transkripsjonssyklus • Fosforylering skjer etter PIC assembly • defosforylering av fri pol eller ved terminering

  26. Fosforylerings-syklus

  27. CTD funksjon • Initiering • Rolle i “rekruttering” av RNAPII til promoter • bare ufosforylert pol deltar i PIC-assembly • Promoter clearance • RNAPII går over i hyperfosforylert elongeringsmodus • CTD fosforylering bryter interaksjoner og RNAPII frikobles fra PIC • Elongering • Samtidig: CTD fosforylering danner nye interaksjoner med elongeringsfaktorer • En rekke nye CTD-bindende proteiner identifisert siste år med funksjoner i splicing og terminering • Tett kobling: transkripsjon - pre-mRNA prosessering

  28. CTD binder også en rekke faktorer Holoenzym = Mediator + core RNAPII • Mediator • RNA processering • RNAPII = ”mRNA factory” som utfører koblet transkripsjon, capping, splicing og prosessering av 3´-ende

  29. Mediator Signal RNAPII TF TFIID TBP Chromatin GTFs TATA Klasse II gener transkribert avRNA polymerase II

  30. GTFs - generelle transkripsjonsfaktorer • Hjelpefaktorer som dirigerer RNAPII til promoter • Trinnvis oppbygging • Dannelse av PIC - pre-initiation complex

  31. 1. Trinn: TATA bindes av TBP • TBP binder TATA - sekvensgjenkjenning • minor groove kontakt • TBP binder også en rekke andre polypeptider • aktivatorer • TAFs (kalles da TFIID = TBP + TAFs) • GTFs (TFIIB, TFIIA) • TBP = universell TF involvert i alle 3 tr.systemene • TBP i SL1, TFIID, TFIIIB protein DNA

  32. TBP = sadel (med TATA som hest) • 3D: Sadel-struktur • Konkav innerside binder DNA i minor groove via 10-stranded antiparallelt b-sheet • Konveks overside binder prot via 4 a-helikser • stigbøyler (“stirrup”) på hver ende

  33. DNA TBP bøyer DNA (stakkars hest) Ikke slik, …….men slik

  34. RNA polymerasen gjenkjenner en GTF-bundet promoter TBP TFIIA TFIIB Dette protein-promoter komplekset er det som gjenkjennes av RNAPII

  35. PIC ”modnes” etter RNAPII- binding TFIIH: multisubenhet med CTD-kinase + helikase for smelting

  36. Mediator Signal RNAPII TF TFIID TBP Chromatin GTFs TATA Klasse II-gener transkribert avRNA polymerase II

  37. PIC-dannelse stimuleres av transkripsjonsfaktorer • Dannelse av PIC styres av TFs som binder elementer oppstrøms • Aktivatorer med høy sekvens-spesifisitet • Rekrutteringspunkt for assembly av komplekser

  38. DBD N TAD C (Oppstrøms)Transkripsjonsfaktorer • Modulær oppbygning - iallfall2 domener: • 1. DBD - DNA-bindingsdomene • 2. TAD - transaktivatordomene • DBD: grunnlaget for gruppering i TF-familier • Sinkfingre, kjernereseptorer, helix-loop-helix, leucin-zippere,osv. • TAD ulike grupper • Tre klasser med ulike targets • sure domener (GAL4, steroid receptor) • glutamin-rike domener (Sp1) • prolin-rike domener (CTF/NF1) • Strukturløse i fri tilstand - 3D i kontakt med target?

  39. Mange ulike TFs • Konstitutive TFs • Konstitutivt uttrykte faktorer som finnes i alle celler • Binder cis-elementer lokalisert nær TATA/INR • Eksempler • CCAAT boks - binder ulike TFs (CTF/NF-I, CBFINF-Y) • GC-rike bokser - binder Sp1 • Regulatoriske TFs • 1. Signal-responsive faktorer • eks.: CRE, HSE, GRE - medierer respons overfor cAMP, heat shock, glucocorticoider • 2. Celletypespesifikke faktorer

  40. Konstitutive Sp1 binder GC-bokser • Noen eksempler

  41. Synergi - mange faktorer stimulerer bedre enn én alene • Mange kontakter gir mer effektiv PIC assembly

  42. Familier - oppdelt etter DBD struktur Zinc finger bHelix-Loop-Helix (Max) STAT dimer Leucine zipper (Gcn4p) p53 DBD NFkB

  43. FamilieSinkfingerproteiner • TFIIIA fra Xenopus var første isolerte og klonede eukaryote TF • Funksjon: aktivering av 5S RNA transkripsjon • Primærstruktur TFIIIA • Bygget opp som repetisjon 9x 30 aa minidomener + 70 aa unik region C-term • Hvert minidomene konservert mønster av 2Cys+2His • Hvert minidomene strukturert rundt et koordinert sink ion

  44. Sinkfingerproteiner • Sink koordineres av 2 Cys + 2 His • Antall fingre varierer: 2-37 • Antall medlemmer uvanlig mange • S.cerevisiae genomet: 147 • C.elegans genomet 535 • Flere hundre humane Zif gener

  45. 3D struktur av sinkfingre • Zif268 - første multi-finger struktur • Hver finger et minidomene med -struktur • major groove kontakt via -heliks i  • gjenkjenning av basetripletter

  46. Kjerne-reseptorer - en sinkfinger-variant • To ”sinkfingre” utgjør en samlet enhet • En finger kontakter DNA • Dimeriserer ved binding til DNA

  47. Kjernereseptorer • Stor familie hvor DBD binder 2 Zn++ via tetraedrisk mønster av Cys • Konservert DBD 70-80 aa • Medierer transkripsjonell respons på komplekse ekstracellulære signal • klassiske steroid hormoner sekretert fra endokrine celler  via blod  målcelle  diffusjon inn  binder reseptor  aktiveres  modulerer målgener • Evolusjonsmessig koblet til multicellulære organismer

  48. Gal4p - enda en sinkfinger variant (6 Cys + 2 Zn)

  49. Leucin-zipper - nesten glidelås • 60-80 aa motiv funnet i en rekke dimere TFs • Prototypiske eks.: GCN4, Fos, Jun, C/EBP, ATF, CREB • mange mulige dimer-partnere gir tallrike kombinasjoner • Dimer-dannelse via parallell coiled coil av a-helikser (ZIP) • Hver 7.aa = Leu • 3.5 aa pr turn (coiled coil) hver 7.aa lik posisjon • Alle Leu samme side og dimerisering via “leucine zipper”

More Related