Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real

1. Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real Fernando Colbari do Amaral

2. Expressão

3. Expressão gênica

4. Comparação de diferentes sistemas gênicos Célula normal vs tumor Comparação da expressão gênica em diferentes tecidos Função gênica específica Comparação da expressão gênica em diferentes populações (cultura de células) Controle vs tratado Estudos de Expressão Gênica

5. Isolamento

6. Genes diferentes Extração de RNA total mRNA´s

7. Quantificação da expressão gênica

9. Métodos de quantificação da expressão gênica • Reação em Cadeia da Polimerase • RT-PCR semi-quantitativa • PCR em Tempo Real

10. Taq DNA Polimerase PCR Primers/Sondas 3´ 5´ 5´ 3´ DNA dupla fita dNTP

11. Síntese de cDNA

12. PCR – 1° ciclo 3´ 5´ Desnaturação 5´ 3´ 3´ 5´ Anelamento 3´ 5´ 5´ 3´ Extensão 3´ 5´

13. Amplificação

15. RT-PCR semi-quantitativa Diluição seriada do cDNA 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 etc...

16. cDNA em concentrações decrescentes 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Amplificação na maior diluição corresponde a uma maior quantidade de cópias do gene na amostra

17. PCR-quantitativo • Método usado para medir a quantidade inicial de ácidos nucléicos (DNA-RNA) que será amplificada por PCR – Sistema Fluorescente • Validação da expressão gênica global • Microarray • SAGE

18. PCR-quantitativo - Eficiência • Preparo da reação (pipetas calibradas) • Qualidade do template (molde) • Desenho dos primers (dimers) • Condições de termociclagem • Concentração dos reagentes (MgCl2) • Tamanho do amplicon (50-150 bp)

19. Características • Fonte de excitação: Lâmpada de Tungstênio • “Sistema aberto” que permite uso de outros fluoróforos, desde que tenham  compatível com os filtros disponíveis • Metodologia de aquecimento e resfriamento de bloco (desnaturação, anelamento e extensão) • Filtros

20. Sistema de detecção

21. SYBR® Green • Intercalante de DNA dupla fita • Fluoróforo em suspensão • Inespecífico • Curva de dissociação ou melting • Não permite multiplex

22. Curva de dissociação • Obrigatória a realização quando utilizar o SYBR® Green – Inespecífico • Permite verificar se há um ou mais produtos de PCR presentes em cada reação • Realizada ao término da termociclagem

23. Sistema TaqMan® • Baseia-se na atividade 5’- 3’ exonuclease • Trabalha com sondas que contém fluoróforos • Específico • Permite Multiplex • Não necessita curva de dissociação • Sonda: Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia

24. R 5’ 3’ Q R Q R 5’ 3’ Q

25. R Q Q R

26. Características da sonda • Localiza-se de 1 a 5 pb do primer • Tm deve ser ~10°C maior Tm dos primers • A primeira base não pode ser G (Quencher) • Não pode ter mais G do que C e não deve ter 4 bases consecutivas iguais • Pode ter Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (Minor Groove Binder)

27. Uracil-N-Glicosilase Desnaturação Ativação da AmpliTaq Gold Anelamento e Extensão Condições de Amplificação Condições Universais para desenho dos oligos: - Amplicon de 50 a 100 pb • Conteúdo de GC • Primers com Tm= 60°C e Sonda com Tm= 70°C Condições Universais de Termociclagem:

29. Fase onde a intensidade de sinal de produto amplificado ainda não ultrapassa a intensidade da fluorescência encontrada no meio. Terminologia Baseline

30. Nível de fluorescência onde a reação é detectada durante a fase exponencial; linha de comparação entre as amostras Terminologia Threshold

31. Ciclo (ponto no tempo) onde a reação cruza o limiar de detecção (Threshold) Terminologia Cycle Threshold (CT)

32. Sinal do Reporter dividido pelo sinal de referência passiva (sinal do ROX). Normalização empregada para corrigir erros de pipetagem Terminologia Rn

33. Tipos de Quantificação • Expressão variável em diferentes tecidos ou diferentes fases do desenvolvimento Músculo Pele Neurônio + + + + + + + + + + + +

34. Tipos de quantificação • Quantificação Absoluta • Determinação do número exato de moléculas. Obtêm-se valores numéricos com alguma unidade, como número de cópias ou nanogramas de DNA. • Quantificação Relativa • Análise comparativa do ácido nucléico alvo com o do controle interno ou do calibrador São comparados os Cts de cada amostra e os resultados representam ordens de grandeza (p.e: 5x mais ou menos expressão de um determinado gene).

35. Controle endógeno • Expressão constitutiva (GAPDH, β-actina, 18S) • Corrigir variações de eficiência da transcrição reversa • Corrigir a presença de inibidores • Corrigir diferenças na quantificação de RNA • Corrigir degradação de material (RNA) • Normalização dos resultados

36. Controle Endógeno ideal • Um bom normalizador é aquele cuja expressão gênica não tenha variação entre os tecidos submetidos a análise • Expressão em A = Expressão em B Expressão no Tratado Expressão no Controle = ~1

37. Quantificação absoluta Necessita de uma curva padrão

38. Quantificação absoluta Cálculos com curva Standard C-myc GAPDH C-mycN _______________________________________________ C-myc Calibrador

39. Quantificação relativa Cálculos sem curva Standard Ct= Ct (alvo)- Ct (controle endógeno) Ct= Ct (sample)- Ct (calibrador) Quantidade Relativa = 2 -Ct

40. Ensaios customizados • Primers e sondas no mesmo tubo. Elimina o passo de balancear as concentrações. • Foco em resultados: elimina tarefas manuais de desenho de primers/sondas • Elimina a necessidade de testar e otimizar ensaios no laboratório • Já vem nas condições universais de construção de primers e termociclagem

41. Custom TaqMan® Gene Expression - Pesquisador envia a sequência e a empresa padroniza o ensaio, dispensando todas as validações o gasto de tempo e reagentes com padronizações. • TaqMan® Gene Expression Assays - Kit pronto disponível (genes conhecidos) • TaqMan® Endogenous Control - Kit pronto disponível

42. Considerações finais • Custo-benefício • Conhecimentos específicos • Validação de resultados • Interpretação estatística