Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila

1. Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila Parsa Kasemi-Esfarjani, et al ; Science 287, 1837 (2000)

2. Plan • Introduction : visée de l’article • Etablissement des lignées polyGln, modèles de la maladie de Huntington • Description de la méthode • Résultats • Suppression de la dégénérescence • Description de la méthode • Résultats • Conclusion

3. Visée de l’article Introduction

4. Introduction • Chorée de Huntington : présente des agrégats de polyglutamine • Utilisation de drosophiles présentant ce phénotype comme modèle de la maladie • Criblage des gènes suppresseurs de ce phénotype • Homologie des protéines entre la drosophile et l’humain

5. Description et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln Description de la méthode

6. Description et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln • Lignées comportant des polyCAG • 20 répétitions : lignée 20Q • 127 répétitions : lignée 127Q • Après traduction des ARNm on aura des polyglutamines de ces 2 types • Utilisation de différents promoteurs pour induire l’expression génique spécifiquement dans les yeux

7. Élaboration préalable de 2 lignées transgéniques

8. Lignées UAS-polyCAG • Insertion d’un élément P contenant : • Promoteur UAS • Séquence polyCAG (20 ou 127 répétitions) • Séquence codant pour un épitope de l’hémagglutinine (HA) Figure : construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile

9. Lignée GMR-Gal4 • Insertion d’un élément P contenant : • Promoteur GMR • Séquence Gal4 codant pour la protéine GAL4 Figure : Construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile

10. Croisement des 2 lignées • Croisement et 3 lignées 20Q et de 3 lignées 127Q par la GMR-GAL4 (fond génétique) • Obtention de drosophiles exprimant les polyglutamines dans l’œil. • Elles sont UAS-polyCAG et GMR-GAL4

11. Induction de la transcription Facteur de transcription spécifique de l’œil 5’ 3’ GMR GAL 4 Transcription de GAL4 Protéine Gal4 ARNm Gal4 Traduction de l’ARNm Gal4 Induction de la transcription 5’ 3’ UAS Poly CAG HA Transcription ARNm Poly CAG HA Traduction Polyglutamine avec épitope HA

12. Elaboration des lignées transgéniques poly-Gln Résultats

13. Phénotypes obtenus • Lignées 20Q : [sauvage] • Lignées 127Q : [agrégation de polyglutamines]

14. Elaboration des lignées transgéniques : Conclusion Utilisation des lignées 127 Q pour trouver les gènes suppresseurs.

15. Criblage et mise en évidence des gènes suppresseurs Description de la méthode

16. Création des lignées transgéniques à testée • 7000 éléments P différents (contenant 7000 séquences autosomales différentes) • Mutagénèse utilisant ces éléments P : obtention de 7000 lignées transgéniques différentes. • Croisement avec les lignées 127 Q

17. Criblage et mise en évidence des gènes suppresseurs Résultats

18. Lignées intéressantes Sur les 7000 lignées croisées avec les drosophiles présentant la dégénérescence, on trouve : • 29 lignées « Enhancer » • 30 lignées « Suppresseur » • On retient Deux lignées Suppresseurs : EU 3500 et EU 3220

19. Techniques utilisées pour mettre en évidence les phénotypes • Microscopie photonique • Aspect extérieur • Immunohistologie • Microscopie électronique à balayage

20. Immunofluorescence • Anticorps secondaire flanqué de l’IPTC • DAPI : marquage des noyaux

21. Résultats

22. EU 3500 EU 3220 Les lignées suppresseurs

23. Lignée EU 3500

25. Lignée EU 3500 • Code pour HDJ1 : protéine homologue de la protéine HSP40/HDJ1 chez l’humain • Domaine J en NH2 terminal (jonction)

27. Lignée EU 3220

29. EU 3220 • Code pour DTPR2 : protéine homologue de la protéine répétée TRP2 humaine (tétratricopeptide 2) • Domaine J en COOH terminal

31. Implication du Domaine J dans la suppression de la toxicité

32. Conclusion • Ce type de criblage permet de trouver les gènes suppresseurs de la toxicité • Agrégats empêchés mais le gène PolyCAG n’est pas réprimé • Prochaine étape : empêcher ce phénotype plus en amont : répression directe des gènes responsables des agrégats