E N D
1. Transgnse vgtale
2. Biotechnologie et plantes Slection traditionnelle
3. Techniques traditionnelles pas si mauvaises mais . longues
4. Introduction Cellule vgtale = totipotente
In vitro = rgnration possible dune plante entire partir dune cellule somatique
Paroi pecto-cellulosique rigide = obstacle au transfert
Deux types de technique:
Mthode physique/chimique
Gnie bactrien (Agrobacterium) : spectre longtemps limit aux dicotyldones
5. Le gne dintrt Premire tape =
Reprage et choix dun gne dintrt
Clonage par insertion dans un plasmide
Transfromation de ce plasmide dans une bactrie (gnralement E. coli)
Multiplication possible de la bactrie
Donc multiplication du plasmide (= amplification)
do obtention de nombreuses copies du gne
do manipulation possible = ralisation de la construction gntique pour le transfert et lexpression chez les cellules vgtales transgniques
6. I- Transfert de gnes chez les vgtaux Succs = conjonction de
Pntration ADN tranger jusque dans les noyaux chez cellules vgtales
Intgration stable dans le gnome de lhte et transmission aux cellules filles
Aptitude des transgnes tre exprims : ncessit de signaux de rgulation de la transcription et de la traduction reconnaissable par machinerie cellule vgtale
Slection des cellules gntiquement modifies = gne marqueur dterminant un caractre de rsistance
rgnration de plantes entires partir des cellules OGM = matrise de la culture in vitro
7. I- Transfert de gnes chez les vgtaux Plusieurs alternatives :
transfert direct
transfert par transformation avec Agrobacterium tumefaciens
La slection des cellules gntiquement modifies:
. petit nombre de cellules modifis sur le total des cellules soumises au transfert : ncessit dune slection
. gne marqueur de transfert (ex: gne de rsistance aux ATB)
. culture des cellules vgtales en prsence de lATB :
cellules gntiquement modifies = se multiplient
autres cellules = meurent
8. I-A- Transfert direct de gnes Si lADN transfr atteint le noyau :
expression possible de lADN ? protine
Expression transitoire
la faveur de la rplication de lADN nuclaire = intgration possible lADN chromosomique
Intgration stable
Pas de dhte vecteur
Information gntique transfrer =
gne dintrt clone dans un plasmide avec au minimum une origine et des fonctions de rplication chez E. coli pour amplification du matriel
marqueur de slection (rsistance ATB) sur le mme plasmide ou sur un second (co-transfert)
Sous forme native circulaire ou linarise (enzyme de restriction)
9. I-A Transfert direct de gnespar transformation de protoplaste Protoplaste = cellules vgtales isoles dbarrasses de leur paroi pectocellulosique par traitement enzymatique
Intrts :
disparition paroi vgtale = disparition barrire au transfert
cellules isoles = facilit de rgnration partir dun unique protoplaste transform et obtention dune plante entirement transgnique
Mthode pour faire pntrer lADN:
chimique :PEG = +++ = dstabilisation membrane plasmique (1982) (Fig 1)
lectroporation: impulsions lectriques brves et fortes = polarisation des phospholipides = pores = passage ADN (1985) (Fig 2)
Physique : fusion entre
protoplastes
liposomes = vsicules artificielles de phospholipides encapsulant lADN transfrer fusionnant (faible rendement de transfert)
Rgnration partir de protolastes transgniques (fig 3)
Limites : uniquement sur vgtaux cultivable in vitro et rgnrable partir dun protoplaste
Intrts : +++ chez monocotyldones rputes insensibles Agrobacterium.
Ex : Riz, Mas, orge
13. I-A Transfert direct de gnes par canon particules ou bolistique Objectif : forcer le passage travers la paroi pectocellulosique (1987)
Cellules: mristme, embryon,
Principe :
. Projection de petites billes dor ou de tungstne (0.6 1.6 mm) enrobs dADN plasmidique (environ 1 mg par bombardement) sous vide
. Pntration sans dommages irrparables aux cellules vgtales
. Solubilisation de lADN transforme au contact de lADN chromosomique nuclaire
. Expression transitoire ou intgration dans ADN chromosomique
. Dveloppement de lorgane traite = plante mosaque avec cellules de ligne germinale transforme
certaines graines = embryon entirement transform
Intrts:
cellules non transformables par Agrobacterium (crales, lgumineuses)
Limites :
cot
prparation des billes enrobes
expression transitoire: stabilit = 0,1 1% des cellules
car difficult de pntration
difficult de rgnration
stress = mortalit
nombre de copies de transgnes/cellules = mal maitris (1 25)
Conclusion:
long et dlicat
faisabilit prouv
soja, coton
17. Paramtres du tir particules (nature, forme, agglomration, dispersion
Mode de prparation et enrobage de lADN:
Circulaire ou linaire
Prcipitation sur particule par ajout de spermidine et de chlorure de Calcium
Taille jusqu 150 kb
Conditions de culture des vgtaux (T, photopriode, hygromtrie)
Tissus les plus aptes la rgnration et la slection des transformants
Cellules en divisions actives = culture de cellules embyognes +++
18. Monocotyledones
20. Aprs bombardement, les cals sont placs sur un milieu slectif contenant un herbicide pendant 3 semaines
23. Tableau 1 P59
24. I-A Autres techniques de transfert physique Electroporation des tissus et des cellules intactes: Cot faible/mise au point difficile
Elctrophorse : schma
Sonication
Traitement de laser
Micro-injection : schma
Synthse (voir tableau)
27. Tableau 3 P65
28. I-B Transfert gntique bactrienLa galle du collet
29. La galle du collet
30. Plantes transgniques et Agrobacterium Phytopathologistes Erwin SMITH: Galle du collet et Agrobacterium tumefaciens
1942 : dveloppement anarchique des tissus vgtaux lemplacement dune blessure = nature tumorale
1960-1970 : INRA Versailles
Tumeur = synthse dacides amins spcifiques appells opines
Absente chez cellules saines
octopine et nopaline drivent de larginine
agropine drive du glutamate
synthse dpendant de A. tumefaciens
opines :
catabolises par les bactries
agissent comme facteurs de croissance
31. Agrobacterium tumefaciens Bactrie du sol
Bacille arobie flagell coloration de Gram ngative
Famille des rhizobiaces
Toutes les plantes ne sont pas sensibles
Tissus infects:
Croissance indfinie en labsence de rgulateur
Synthse dune nouvelle classe de molcules de faible masse molculaire: les opines (nopalines, actopine, mannopine, agrocinopine)
Prsence simultane de cellules vgtales transformes et non transformes
32. Origine des tumeurs: rle du plamside Ti (tumor-inducing plasmide) - 1974 Possibilit dhoter leur pathognicit aux souches dA. tumefaciens
Possibilit pour les souches avirulentes de devenir virulentes au contact des souches virulentes
Suggrait lexistence dun lment gntique extra-chromosomique
Prsence de larges plasmides chez A. tumefaciens
Prsence corrle la virulence
Plasmide Ti pour Tumor-inducing
33. Ti Plasmid Grand plasmide : 200-kb
Plasmide conjugatif
~10% de linformation du plasmide sont transfrs aprs infection par le plasmide = ADN-T
Integration de ce ADN-T = au hasard dans lADN nuclaire des cellules vgtales
Plasmide Ti code:
enzymes impliques dans le mtabolisme des opines
protines impliques dans la mobilisation de lAND-T (gnes Vir)
34. Plasmide Ti
35. Gnes Vir (virulence) Situs sur le plamsides Ti
Assure le transfert de lAND-T chez la plante
Activs par lacetosyringone (AS) (flavonodes) libr par une plaie sur le vgtal
7 groupes de gnes : virA,B,C,D,E,F,G reprsentant 30 kb sur le plamside Ti
36. Fonctions des gnes Vir virA : assure le transport dAS dans la bactrie et une activation post-transcriptionelle de Vir G
virG : assure linitiation de la transcription des autres gnes Vir
virD2: endonuclease qui coupe lAND-T aux extrmits sur un simple brin 5
virE2 : protine de liaison de lADN simple brin dans la cellule vgtale et adressage dans le noyau
virB : 11 ORFs assurant le transfert des complexes AND-Protine travers les membranes cellulaires
40. Plasmide Ti
42. Expression de lADN-T chez la cellule vgtale Modification du mtabolisme
Modification de la sensibilit des substances de croissance
do responsable du phnotype tumoral
LADN-T de A. tumefaciens est excis et intgr dans le gnome vgtale selon un mcanisme naturel dinfection
Tout fragment dADN situ entre les bords L et R de lADN-T sera transfr
43. Agrobacterium rhizogenes Au site de blessure = systme racinaire chevelu (hairy-root)
44. Agrobacterium et plantes transgniques Introduction de gnes nouveaux dans des plantes
Utilisation des particularits dAgrobacterium
Plasmide Ti =
rgions essentielles la mobilisation et lintgration dADN bactrien chez la plante :
Squences rptes de 25 pb bordant lADN-T
Gnes de virulence vir
Rgions dlter:
Gnes de synthse dauxine
Gnes de synthse des cytokinines
On parle de plasmide Ti dsarms
Problme : Impossibilit de cloner directement les gnes dintrt dans les plasmides
dveloppement de vecteurs particuliers
squences transfrer places dans un vecteur :
aisment manipulable in vitro
taille rduite
capable de se multiplier chez E. coli
2 types de stratgie : systme 2 vecteurs
systme vecteur co-intgr
46. Vecteur co-intgr Plamside Ti hybride
48. Vecteur co-intgr Plamside Ti hybride
51. Systme binaire de transformation
52. Systme binaire de transformation
53. Systme binaire de transformation
54. Vecteur binaire Strategie:
Placer lADN-T sur un petit plasmide indpendant
Enlever les gnes aux et cyt (absence de tumorisation)
Insrer un marqueur de slection (gne de rsistance) sur lADN-T
Gnes Vir placs sur un plasmide indpendant
Placer les gnes trangers entre les extrmits de lADN-T
Raliser une co-transformation dAgrobacterium avec les deux plasmides
Infecter la plante avec les bactries transforme
Aprs slection et rgnration, rcupration de plantes avec des gnes prsents dans toutes les cellules : obtention dun plant transgnique
56. Vecteur bas sur plamside Ti
58. II - Rgnration in vitro des plantes transgniques Agrobacterium tumefaciens
59. Rgnration in vitro des plantes transgniques Pour bon nombre despces de plantes: possibilit de rgnrer une plante partir dune cellule isole
Utilistaion dhormone vgtales induisant une multiplication de scellules et leur diffrencaition (racines, tiges, feuilles, )
Plantes ainsi rgnres capables de se reproduire normalement
Sur cellules transformes = obtention dune plante dont toutesles cellules portent le transgne qui se transmettra selon la loi de MenDEL comme les gnes endognes
60. Rgnration in vitro des plantes transgniques Agrobacterium rhizogenes
61. Transformations in planta Imbibition des graines:
Graines incubes avec A. tumefaciens avec vecteur binaire rsistant la kanamycine
0.32% des graines Kanamycine R
Transformation par infiltration
Infloraiscence trempes dans solution dAgrobacterium portant un vecteur binaire
..
65. Applications majoritaires En termes de surface cultive avec transgniques:
Rsistance aux herbicides = 79%
Rsistances aux insectes = 29%
Autres applications < 1%
66. Applications majoritaires En termes de surface cultive avec transgniques:
67. Comparatif OGM/Traditionnel
69. Adaptation des plantes au milieu Rsistances aux pathognes
Pertes = 37% de la production mondiale (1/3=insectes)
Limitation de lutilisation des pesticides = polluant
Rsistances aux insectes:
toxine de B. thuringiensis
antiprotases vgtales
70. Cas dune OGM gnrant un insecticide(gnes de la bactrie Bacillus thuringiensis)
73. P136
74. P136
75.
USA : Bl BT = 26%
Intrts/inconvnients :
Toute la plante est imprgn de linsecticide
Pas de main doeuvre
Diminution de lapplication dinsecticides (??)
Pb de la slection dinsectes rsistants
Pression de slection forte des plantes Bt
Pb de dynamique des populations
Stratgie des aires de refuges
Stratgies de double rsistance
76. Enjeux ecologiques Toxicit du pollen Bt pour les chenilles de papillon monarque en bordure de champs Bt
mais risque pas plus important quavec insecticides
Dispersion des gnes de rsistance aux antibiotiques
mais existence de systme pour eciser les gnes de R
Pollinisation de varits dans les champs voisins
car transport pollen par le vent
pb pour le maintien de lagriculture biologique
Transfert horizontal vers des varits sauvages
do risque de pullulation de certaines espces
78. Cas dune OGM rsistante un herbicide (Glyphosate, ...)
82. Tolrances aux virus Perte de 10% de perte
Diffrentes stratgies
Expression du gne de la protine de capside
Expression dARN satellite et dARN antisens
Blocage des mouvements intercellulaires
88. Particularits des protines recombinantes usage biopharmaceutique produites par transgnse Pas de bioracteurs : culture en plein champs
Source de biomasse la plus accessible :
feuilles (tabac, luzerne)
. mtabolisme actif et complexe = protines complexes possibles
. activit protasique ++ = limite laccumulation
graines (colza, soja, mas, riz, )
moins deau = protines plus stables
stockage sans dgradation pendant plusieurs mois
necessit de floraison = risque de dissmination ++
Rgnration et propagation trs facile des cellules gntiquement modifies (cellules de cals)
Propagation par bouturage dans certains cas (luzerne)
89. Environnement
90. Sant
91. Les industriels des biotechnologies
92. Les Brevets
93. Le Tiers Monde