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RNA interference 2006 Nobel Prize in Medicine

RNA interference 2006 Nobel Prize in Medicine. A 班第二組 05 王德雄 09 江孟軒 25 周大鈞 34 林炯宏 36 林瑾薏 46 張恩慈. RNAi 發現經過及實驗. short RNAs identified in plants. RNAi shown in vitro. siRNAs identified. Dicer identified. genome-wide RNAi screens begin. RNAi used against HIV. Timeline. 1990.

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RNA interference 2006 Nobel Prize in Medicine

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Presentation Transcript

  1. RNA interference2006 Nobel Prize in Medicine A班第二組 05王德雄09江孟軒25周大鈞34林炯宏36林瑾薏46張恩慈

  2. RNAi發現經過及實驗 short RNAs identified in plants RNAi shown in vitro siRNAs identified Dicer identified genome-wide RNAi screens begin RNAi used against HIV Timeline 1990 cosuppression of purple color in plants dsRNA injection in worms 1998 1999 RISC activity partially purified 2000 2001 2002

  3. RNAi發現經過及實驗 Plant experiment

  4. RNAi發現經過及實驗 The Key Experiment • Caenorhabditiselegans（秀麗隱桿線蟲 ） • millimeter-long

  5. RNAi發現經過及實驗 in vitro transcribe an antisense RNA: cap AAAA... mRNA can no longer be translated into a protein The Key Experiment

  6. RNAi發現經過及實驗

  7. Double-stranded RNA-induced RNA interference causes destructionof a specific mRNA in C. elegans

  8. RNAi的機制

  9. RNAi的機制

  10. RNAi的機制 steps • 由外源導入或transposon、病毒感染的dsRNA經由ATP依賴方式的Dicer切割成siRNA • siRNA與PAZ、MID、PIWI、N結合成RISC • MID可以activate RISC，使之與目標mRNA結合 • PIWI切割mRNA • 目標mRNA分解

  11. dsRNA：雙鏈RNA Dicer酶 ：可以切割dsRNA 雙鏈siRNA ： dsRNA被切割後的產物 (21~23個鹼基 ) 單鏈siRNA：由siRNA雙鏈結構解開 RISC ： siRNA和protein的複合體 RNAi的機制 siRNAi的作用機制

  12. RNAi的機制 siRNA structure

  13. RNAi的機制 RNase III signatures amino-terminal helicase domain connector helix PAZ domain Dicer的結構及切割機制

  14. RNAi的機制 Dicer的結構及切割機制 • 需要dsRNA binding proteins • 辨識機制： 藉由RNase III signatures和PAZ domain間的距離（65埃）來辨識siRNA分子（25個鹼基長）。

  15. RNAi的機制 RISC的組成 • RISC是由一類名為Argonaute2的蛋白質所構成。依其構造可分為四部份：PAZ、Mid、PIWI、N (如圖所示) PAZ可以辨認siRNA的3‘端並和之結合； PIWI是屬於RNase H 家族成員之一，因此含有核酶活性，得以進行mRNA的切割。 Mid則是可形成一個和PIWI吻合的deep basic pocket surface，並和siRNA的5’端的P結合，使RISC活化且更穩定，也使RISC更能在正確位子和mRNA結合。

  16. RNAi的機制 siRNAi的信號擴增系統 • 線蟲的實驗(探討siRNA遺傳現象) • 被RISC切斷的mRNA片段可以被RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)附著，並進行複製，形成一dsRNA。Dicer酶再對dsRNA進行切割，造出新的雙鏈siRNA。如此不斷循環，便可達到信號擴增的效果。 • 請仔細看影片

  17. miRNA

  18. RNAi的機制 steps • 由基因組中轉錄出pri-miRNA • 在microprocessor complex 中被切割成70個鹼基的pre-miRNA(髮夾狀) • pre-miRNA被Exportin-5由細胞核運到細胞質中 • Dicer酶能以ATP依賴方式切割pre-miRNA • pre-miRNA變成 20~22個鹼基的miRNA duplex

  19. RNAi的機制 steps • miRNA duplex被分解成兩個單鏈miRNA • 其中一鏈會成為mature miRNA • mature miRNA和一群蛋白質形成RISC • RISC會和標靶mRNA結合，使之分解或不能轉譯

  20. RNAi的機制 miRNA的作用機制 • pri-miRNA ：由基因組中轉錄出來 • Drosha ：一種RNaseIII • pre-miRNA：由Drosha切割pri-miRNA 而來 • Exportin-5 ：可將pre-miRNA由細胞核運到 細胞質。 • miRNA duplex ： pre-miRNA被切割後的產物 (20~22個鹼基 ) • mature miRNA：有活性的單鏈miRNA

  21. RNAi的機制

  22. siRNA和miRNA的比較 相同點

  23. 相異點

  24. 相異點

  25. Huntington’s disease RNAi的應用 • Normal HD gene • Mutant HD gene (CAG repeat) • Polyglutamine disease

  26. 患者的腦部掃描(基底核)

  27. RNAi and Huntington’s disease RNAi的應用 • 正常HD gene和突變HD gene的差異(CAG repeat) • Off-target effect • SNPs, single nucleotide polymorphisms

  28. Challenging problems RNAi的應用 • 適合的載體? Adeno-associated virus • Spinocerebellar Ataxia Type 1

  29. RNAi and antivirus RNAi的應用 • RNAi和抗病毒的關連性

  30. RNAi and HIV RNAi的應用 • CCR5, a co-receptor of HIV • Chemokine receptor • Co-receptor的隱憂

  31. CCR5的構造 • G-protein-linked receptor

  32. RNAi的應用 基因研究的改良 傳統作法: 利用自然發生的突變種不斷交配，得到大量純種需要研究之素材。 問題：1.突變種的多樣性 2.得到大量素材所需時間 RNAi的改良：1.可針對特定的基因做抑制 2.操作簡單 3.可在細胞發育任何階段執行

  33. RNAi的應用 癌症治療的應用 1.細胞週期素依賴CDK-2 在調控細胞週期中發揮關鍵作用,利用特定序列的dsRNA去阻斷CDK-2 2.直接抑制制癌基因 3.抑制腫瘤細胞中與血管生長相關的生長因子 即可治療腫瘤細胞異常增值或是抗腫瘤轉移 Ex.結腸癌—Survivin(凋亡蛋白抑制劑) 子宮頸癌—HPV基因(人類乳突病毒的治病基因) 乳腺癌—Spl基因(與細胞增值分化相關的核轉錄基因)

  34. 結語 • 新興的基因組斷技術!! (cp.傳統針對蛋白質作用) • 仍存在之問題 1.siRNA的設計困難? 2.RISC的組裝步驟及其相關蛋白如何與siRNA組合、活化? 3.如何找到一種高效、低毒適合人體的轉運載體?

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