Glutation és a kapcsolódó mechanizmusok Fitokelatinok, metallotioneinek

1. Glutation és a kapcsolódó mechanizmusokFitokelatinok, metallotioneinek

2. A nehézfémfelesleg hatásai • Más elemek gyökér általi felvételének befolyásolása (Cd, Cu, Zn) • Szabad oxigéngyökök generálása Cu+ + O2→ Cu2+ + O2.- Cu+ +H2O2→ Cu2+ + OH- + OH. lipidperoxidáció iniciálása Cu+ + LOOH → Cu2+ + OH- + LO. Cu2+ + LOOH → Cu+ + H+ + LOO. • Enzimek működésének gátlása (pl. NR-t az Pb) • Klorofill bioszintézis gátlása (δ-aminolevulinsav DH, protoklorofillid reduktáz)

3. A nehézfémfelesleg hatásai A nehézfém-toxicitás általános tünetei • gyökér- (hajtás-) növekedésének gátlása • vízfelvétel- és belső vízmozgás gátlása Különösen magasabb koncentrációban a legtöbb nehézfém: • gátolja sztómák nyitódását és a transzspirációt • CO2-fixáció, a fotoszintézis egyes folyamatainak gátlása • károsítja a plazmamembránt

4. A nehézfémrezisztencia lehetséges mechanizmusai • Elkerülés (baktériumban P-típusú ATPázok kipumpálják) • Detoxifikálás a sejten belül (kelatálás, transzport) - fehérjék indukciója hősokk (Heat-shock) proteinek, metallotioneinek, fitokelatinok, ferritin, transzferrin - antioxidáns enzimek indukciója és aktiválása szuperoxid dizmutáz, kataláz, glutation peroxidáz - szerves savak magasabb „turnover”-e malát, citrát, oxalát, fitát, szukcinát stb. A nehézfémtolerancia fontos a nehézfém hiperakkumuláláshoz !

5. A Cd kelatálásában és vakuólumba juttatásában központi szerepe van a glutationnak

6. Antioxidáns védő mechanizmusok

7. Az aszkorbinsav-glutation ciklus szerepe a H2O2 eltávolítása

8. A glutation

9. A glutation szerepe a növényekben Előfordulása: kloroplasztiszban,citoszólban, mitokondriumban mM-os nagyságrendben (500 µM - 5 mM) Redukált/oxidált glutation aránya: normál körülmények között: 90-99 % stresszhatásra: 30-80%

10. Redukált glutation – oxidált glutation 2 GSH → GSSG Oxidált glutation = glutation diszulfid

11. A glutation szerepe a növényekben • Oxidatív stressz elleni védelem (GR, GSPX) • Szubsztrátja a glutation S-transzferáznak • Redox puffer, redox szabályozás (fehérjék -SH csoportja, sejtciklus) • Génexpresszió szabályozása • Fitokelatinok prekurzora • Fő raktározott formája a redukált kénnek • A szervek közötti kénmegoszlás szabályozása

12. A glutation bioszintézise

13. A glutation szintetáz, GS (GSase) Transzgénikus nyárfa Citoszolban, 100-szoros GS-növekedés, GSH tartalom nem nőtt Transzgénikus Brassica j. : 2-3-szoros növekedés a Cd-toleranciában

15. g-glutamil ciszteinszintetáz, g-ECS Szerepe bizonyított a GSH szint emelkedésben stresszhatásra Transzgénikus nyárfa: citoszolban: enzim mennyiségben 5-10-szeres növekedés, 2-3-szoros GSH- és GSSG- szint növekedés (a redox állapot nem különbözött a kontrolltól !) Kloroplasztiszban: hasonló eredmény Transzgénikus Brassica j. : 2-3-szoros növekedés a Cd-toleranciában Transzgénikus dohány: nekrózis, csökkent növekedés

16. A bioszintézis génjének túltermeltetésével a glutation mennyisége megemelhető növényekben

17. Glutation reduktáz, GR • Transzgénikus nyárfa kloroplasztiszban: 1000-szeres GR-növekedés 2-szeres növekedés a glutationban (aszkorbát mennyisége is nőtt stresszhatásra) citoszolban:5-10- szeres GR növekedés glutation mennyisége nem nőtt GR overexpresszió a kloroplasztiszban növeli a GSH/GSSG arányt és a totál glutation mennyiséget is • Transzgénikus dohány: 1-3,5-szörös GR növekedés

18. Glutation bioszintézis és homeosztázis összetett szabályozása

19. A glutation szintézise, felhasználása és lebontása a növényi sejtben GSH: redukált glutation, Glu: glutaminsav g-ECS: g-glutamil ciszteinszintetáz, GSase: glutation szintetáz, GSSG: glutation diszulfid, GRase: glutationreduktáz, GST: glutation S-transzferáz, PCS: fitokelatin szintetáz, CPase: karboxipeptidáz, g-GTase: g-glutamil transzpeptidáz, DPase: dipeptidáz

20. A glutation S-transferáz (GST) szerepe • Különböző elektrofil komponensek konjugálása GSH-val (endogén metabolitok, gyomirtószerek detoxifikálása ) • GSH-PX funkció→ lipid peroxidok detoxifikálása GST/GS-PX gént túltermelő transzgénikus dohány növények megemelkedett stressz toleranciával rendelkeznek • izomerizációs reakciók katalizátora (pl. aromás aminosavak lebontásában) • nem-enzimatikus szállító (ligandin-funkció): endogén molekulák kötése nem-katalitikus helyen (kötés és transzport) - auxin- és citokinin-kötő fehérjék - cianidin-3-glukozid vakuolumba történő transzportja - intracelluláris hormon transzport? • Apoptózis szabályozása - véd a letális hatástól („Bax-inhibitor GST”)

21. A fitokelatinok • Fémkötő polipeptidek (γ-Glu-Cys)2-11-Gly a felesleges, toxikus fémionok megkötése, kizárása, elkülönítése

22. A fitokelatinok

24. A fitokelatin szintáz (PCS) • Nehézfémek és tiolátjaik aktiválják (Cd2+, Zn2+ ,Cd.GS2,Zn.GS2) C-terminális részen Cys-csoportok fontosak az aktiválásban • cad1 mutánsok (Arabidopsis, S. pombe) mutáció a PC szintázban - Cd2+ -ra, Cu2+-ra hiperszenzitívek - fitokelatin-deficiensek • PCS-expresszáló transzgénikus sejtek Cd2+-toleranciája és -akkumulációja, nagyobb, mint a kontrollé (S. pombe, S. cerevisiae, dohány, Arabidopsis)

26. A fitokelatinok Cd2+ kapcsolódása két fitokelatin molekulával

27. A fitokelatinok

29. A fitokelatinok • A Cd2+-ot jól toleráló sejtekben a Cd2+ min. 90%-a Cd-fitokelatin komplex formájában található • A Cd-fitokelatin komplexek általában a növényi sejtek vakuólumában találhatóak • Transzporterük: ABC-transzporter (HMT1: heavy metal tolerance factor 1)

30. A vakuólum a növényi sejtek 90%-át is kitöltheti

31. Fitokelatin-közvetített Cd-transzport és Cd-S komplexek kialakulásának modellje

33. A kén csökkenti a Cd toxicitását

34. A metallotioneinek Kis molekulasúlyú, ciszteinben gazdag fémkötő proteinek (8-14 kDa, 50-70 aminosav, >30% Cys) „fitokelatin aggregátumok” ? Fitokelatinokhoz hasonló szerep a fémek komplexálásában (nagyobb affinitás a Cu-hez) Antioxidáns funkciójuk is lehet (membránok védelme) Génexpressziójukat befolyásolják pl. nehézfémek (Cu, Zn, Cd), sebzés, öregedés, patogén fertőzés.

35. S. cerevisie metallotionein A metallotionein molekula szerkezete, kiemelve a Cys csoportok S atomjait (világosabb gömbök ) és a kötött Cu atomokat (sötétebb gömbök)

36. A metallotioneinek csoportosításaaminosav sorrend és összetétel alapján I. típus: 20 Cys-t tartalmaznak (6 Cys-X-Cys két fő doménban, köztük kb. 40 aminosav) II. típus: N- és C-terminális részen más, konzervált elrendezésben vannak az aminosavak (pl. Cys-Cys, Cys-Glu-Glu-Cys, MSCCGGNCGCS) tipikusan növényi MT III. típus: N-terminális részen csak 4 Cys, C-terminálison 6 enzimatikusan, nem transzlációsan szintetizálódnak! IV. típus: 3 Cys-gazdag domént tartalmaznak (5-6 Cys), köztük 10-15 aminosav)

37. Egy metallotionein feltételezett szerkezete Az N- ás C-terminális részenlévő Cd- (kék gömbök) kötő fém-centrumokat hosszabb fehérjelánc köti össze.

38. A metallotioneinek Génexpressziójuk különbözhet szövettől függően is: I. típus gyökérben jobban expresszálódik, mint hajtásban, II. típus ellenkezőleg III. típus expressziója magas levelekben és éretlen termésekben IV. típus fejlődő magvakban expresszálódik. Nyárfában 6 MT expresszióját vizsgálták, eltérő mintázat

39. A nehézfémrezisztencia lehetséges mechanizmusai • Fémionok immobilizálása a sejtfalban (pektinek) • PM permeabilitás változása, kompartmentizáció a vakuólumban • Aktív kijuttatás • Kelátképzés a citoplazmában, vakuoláris transzport

40. Lehetőségek a növények nehézfém rezisztenciájának, akkumulációjának, transzportjának növelésére