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TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO. TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO. Cuantificación del número de moléculas por célula Determinación de moléculas solubles Enumeración celular Nuevas formas de marcaje 4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes 4.2 Marcaje intracelular

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TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

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  1. TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

  2. TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO • Cuantificación del número de moléculas por célula • Determinación de moléculas solubles • Enumeración celular • Nuevas formas de marcaje 4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes 4.2 Marcaje intracelular 4.3 Marcaje de proteínas totales

  3. 1) CUANTIFICACIÓN DEL NÚMERO DE MOLÉCULAS POR CÉLULA INDIVIDUAL

  4. Cuantificación del número de moléculas por célula individual • Cuantificación del número medio de moléculas por célula • La cantidad de antígeno que contiene cada célula se expresa en ABC (antigen binding capacity) o capacidad de unión antigénica

  5. CUANTIFICACIÓN DE ABC 1.1) QUIFIKIT 1.2) RAINBOW BEADS

  6. 1.1) QUIFIKIT: FUNDAMENTO • Micropartículas de calibración con cantidades determinadas de IgG unidas. • Se emplea un segundo anticuerpo fluorescente anti-IgG. La fluorescencia por micropartícula es proporcional a la cantidad de IgG unida • Se realiza una curva de calibración entre la intensidad media de fluorescencia frente a la capacidad de unión de anticuerpo (ABC)

  7. PROTOCOLO DE MARCAJE

  8. PROTOCOLO DE MARCAJE

  9. QUIFIKIT

  10. QUIFIKIT

  11. REALIZACIÓN DE LA RECTA ESTÁNDAR • Unión media bruta (ABC media bruta) relaciona la intensidad de fluorescencia con la capacidad de unión • Se obtiene la formula de la recta que nos permitirá deducir la ABC media bruta de cada célula a partir de su intensidad de fluorescencia media

  12. 4 voltage 453 (r2=0.999) voltage 463 (r2=0.999) log MFI (mean fluorescence intensity) 3 voltage 473 (r2=1) voltage 483 (r2=0.999) 2 voltage 493 (r2=0.999) 1 0 3 4 5 6 log ABC (antigenic binding capacity) RECTA DE REGRESIÓN

  13. 1.2) RAINBOW BEADS Micropartículas con número conocido de moléculas de fluorocromos unidos covalentemente

  14. RAINBOW BEADS Patrón Problema

  15. RAINBOW BEADS

  16. CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA • Asunción: el control negativo tiene cero moléculas del antígeno Problema: emite fluorescencia inespecífica • Hay que tener en cuenta el número de fluorocromos por anticuerpo

  17. CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA • La capacidad de unión específica (ABC específica o neta) es igual a la cantidad de moléculas antigénicas expresadas por cada célula. Experimentalmente se determina como la ABC media para el anticuerpo específico menos la ABC media del control negativo

  18. DIFERENCIACIÓN DE POBLACIONES EN BASE A UNA DETERMINADA MOLÉCULA • En linfocitos CD4 activados disminuye la intensidad de expresión del correceptor CD4. En linfocitos CD8 activados aumenta la expresión del correceptor CD8 • Activación TCR modulación de CD3 • La apoptosis reduce la expresión de determinados antígenos de linaje

  19. 2) CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS SOLUBLES

  20. FUNDAMENTO El numero medio de moléculas de citocina capturadas por cada partícula se relaciona con la concentración de la citocina en el sobrenadante

  21. PROTOCOLO Incubación Lavado Marcaje Lavado

  22. SSC - - + + Citocina Citocina DETERMINACIÓN DE CITOCINAS SOLUBLES

  23. CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS SOLUBLES • Más rápido y sensible que el ELISA. 90 min. Sensibilidad fentomolar: 10-15 M • Multiparamétrico

  24. 3) ENUMERACIÓN CELULAR

  25. ENUMERACIÓN CELULAR • Los métodos anteriores proporcionaban una cifra relativa de las células que están proliferando • - Este método ratiométrico permite calcular el número absoluto de células con respecto a las que sembramos inicialmente

  26. CULTIVOS CELULARES Células PHA Medio

  27. R1 R2 R1 R1 R2 R2 ENUMERACIÓN CELULAR Tras cultivo CÉLULAS T CÉLULAS B MICROPARTÍCULAS Crecimiento Basal Muerte celular

  28. ENUMERACIÓN CELULAR Crecimiento Tras Cultivo Apoptosis

  29. CÁLCULO DEL NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULAS N0 = concentración celular inicial Nt = concentración celular a tiempo t Nt = (Ratiot/ Ratio0) * N0 Ratiot = (Célst / Partículast) Ratio0 = (Céls0 / Partículas0)  t. Partículas = cte. Nt = (Célst/ Céls0) * N0

  30. ENUMERACIÓN CELULAR Basal 4000 2000 =2 Crecimiento 150.000 céls 2x = x = 100.000 céls Apoptosis 1000 2000 =0.5 Células 2000 Partículas 2000 = 1 = 1 50.000 céls 0.5x = 2000 2000 =50.000 céls x = 25.000 céls

  31. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ENUMERACIÓN CELULAR • Centrifugación • Sedimentación de células y micropartículas • Número de células y de micropartículas adquiridas

  32. 100 90 80 70 60 % de recuperacióncelular 300 g 200 g 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 Número de lavados CENTRIFUGACIÓN CELULAR

  33. 1.Adquiridas inmediatamente Tras 20 minutos: 2. Adquirir 3. Agitación manual. 4. Vortex * * 0.0 .2 .4 .6 .8 Ratio Céls/Micropartículas SEDIMENTACIÓN DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS

  34. 14 12 CV del ratio 10 8 6 4 2 10 100 0 0.1 1 Ratio células/partículas NÚMERO DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS ADQUIRIDAS

  35. VALIDACIÓN DEL MÉTODO • Precisión • Coeficiente de variación (CV) • Sensibilidad • Límite de sensibilidad • Exactitud • Linealidad

  36. 60 Citometría de flujo Contadores celulares 50 Microscopía 40 CV (%) 30 20 10 0 1 10 100 1000 Células/ml x 10-3 ESTUDIO DE LA PRECISIÓN Y DE LA SENSIBILIDAD

  37. 1000 800 600 Nº absoluto de células x 10-3 400 r= 0.9891 r = 0.9956 r= 0.9997 200 0 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 40 50 60 70 Nº medio de células x 10-3 Nº medio de células por campo Ratio céls/micropart ESTUDIO DE LA EXACTITUD Contadores celulares Microscopía Citometría De flujo

  38. ENUMERACIÓN DE CÉLULAS APOPTÓTICAS • Las células apoptóticas se fragmentan en cuerpos apoptóticos • Las células apoptóticas pierden la expresión de antígenos específicos de linaje.

  39. FRAGMENTACIÓN CELULAR Una célula apoptótica se fragmenta en varios cuerpos apoptóticos. ¿Cuál es el límite en FSC entre las células apoptóticas y los cuerpos apoptóticos?

  40. Permeabilidad de membrana Tamaño celular FRAGMENTACIÓN CELULAR Aunque se pudiera precisar el límite, perdemos células ya fragmentadas que escapan del gate de análisis.

  41. INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS Prevalencia = apoptóticas /viables+apoptóticas = (1/5) 20% = prevalencia de la apoptosis Incidencia = (apoptóticas + fragmentadas+ pérdidaAg) / total = (6/10) 60% = incidencia de la apoptosis

  42. INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS (1/10) = 10 % prevalencia Incidencia = (1/10) 10%

  43. APOPTOSIS TEMPRANA (4/9) = 44% prevalencia Incidencia (5/10) = 50%

  44. APOPTOSIS TARDÍA Incidencia = 60% (1/5) = 20 % prevalencia Fragmentación celular Cuerpos apoptóticos

  45. IMPACTO DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR EN LA MEDIDA DE LA APOPTOSIS 0 hours 6 hours 24 hours

  46. PÉRDIDA DE ANTÍGENOS ESPECÍFICOS DE LINAJE (AEL) Si las células apoptóticas pierden su AEL, la prevalencia de la apoptosis en la población positiva será menor que su incidencia en la población original

  47. APOPTOSIS INDUCIDA POR CICLOHEXIMIDA AI TOTAL ALL AI HIGH BRIGHT AI MED DIM AI LOW NEG 100 80 60 Porcentaje de células apoptóticas 40 20 0 CD3 CD8 CD4 CD19 AEL

  48. Estudio de la expresión de AEL en células en diferentes estadios de la apoptosis MFI 004 MFI 015 MFI 061 MFI 131 CD19 on B-CLL leukemic cells Apoptóticas tardías Apoptóticas intermedias Apotóticas tempranas Células viables

  49. 140 120 100 80 MFI 60 40 20 Early Apoptotic Intermediate Apoptotic Viable cells Late Apoptotic ESTADIO DE LA APOPTOSIS PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD19) POR CÉLULA INDIVIDUAL

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