Terapia Genica

1. Terapia Genica • E’ un approccio moderno per trattare, curare o in ultima analisi prevenire una malattia cambiando l’espressione di uno o più geni. Può essere applicata a cellule somatiche o a cellule germinali. • La terapia genica allo stato attuale è largamente sperimentale. La terapia genica germinale non è ad animali di grossa taglia e all’uomo.

2. Gene therapy in medicina interna • Definizione: modificazione di un fenotipo mediante trasferimento di (un) gene. • Notevolmente sviluppata dal punto di vista sperimentale in modelli cellulari ed animali. • Relativamente avanzata dal punto di vista clinico.

3. Cosa è realmente la terapia genica? • Per inserire un gene in un sistema complesso bisogna innanzitutto avere un gene. • La terapia genica fornisce quindi uno strumento per conoscere meglio le funzioni dei geni e delle proteine da essi codificati.

4. A cosa serve la terapia genica? • Cancro: cellule tumorali, progenitori ematopoietici,T-cells, fibroblasti, cellule muscolari. • Disordini ereditari monogenici: cellule epiteliali polmonari, macrofagi, progenitori ematopoietici, epatociti, cellule muscolari. • Malattie infettive: cellule T, progenitori ematopoietici, cellule muscolari. • Malattie cardiovascolari: cellule endoteliali, cellule muscolari. • Artrite Reumatoide: cellule epiteliali sinoviali. • Sindrome del tunnel Carpale: cellule nervose.

5. Sistemi di gene transfer • DNA nudo • Lipidi cationici • Particelle di DNA condensato • Gene guns • Virus

6. Dna nudo • Funziona meglio in vivo che in vitro. • Uso: vaccini. • Pro: economico e facilmente maneggiabile. • Contro: poco efficiente, breve espressione, non si presta a selettività tissutale, crea infiammazione (CpG non metilate).

7. Lipidi Cationici • Legano il DNA mediante interazioni elettrostatiche (non covalenti) • Transitorio • Uso: Fibrosi Cistica (entra bene nell’epitelio polmonare) • Pro: come il DNA nudo. • Contro: bassa efficienza, breve espressione.

8. DNA condensato • I polimeri usati sono: polilisine, oligopeptidi,imine polietileniche. • Pro: si presta a future manipolazioni può prababilmente favorire la selettività se usato insieme ad altre tecnologie. • Contro: come si fa a far andare il dna nel nucleo (dove deve replicarsi).

9. Gene Guns • Cannoncini che sparano il DNA nudo o nelle cellule (difficile in vivo) o nell’interstizio. E’ un alternativa all’iniezione. • Pro: bassa immunogenicità. Sostituirà l’ago nell’iniezione di DNA nudo. • Contro: Si può sparare sulla pelle, ma quali altri organi?

10. Elettroporazione • Mediante delle differenze di potenziale (scariche elettriche) si fanno dei buchi sulla membrana citoplasmatica e il DNA entra nelle cellule. • Poco applicabile in vivo, in vitro “uccide” molte cellule.

11. Vettori virali • Adenovirus. • Retrovirus. • Virus Adeno associati (AAV): Parvo virus.

12. Adenovirus • I più efficaci sistemi di gene transfer a disposizione. • Oltre 50 sierotipi di AV umani. • In G.T: si usano quasi esclusivamente il sierotipo 2 e 5, in più comuni. • 36 Kb DS-DNA. • >50 polipeptidi divisi in: -E1 fattori di trascrizione. -E2 replicatori genoma virale -E3 Fattori prottetivi immunogeni -E4 replicatore genoma virale First generation: E3 def. Circa 7.5 KB Newer generations: E1,E2/E4.

13. Promotore CMV. • Fegato sito di maggiore uptake. • Pro: molto efficaci, elevata e rapida espressione, relativa specificità. • Contro: tossici, rapida eliminazione, molti umani sono già sensibilizzati, spesso contaminati.

14. Retrovirus • SS-RNA avviluppato in lipidi, 7-11 KB, si inseriscono nel genoma dopo essere stato retrotrascritto. • Si divide in: Onco Retrovirus, Lenti virus, Spuma virus. • Infezioni croniche. Ben tollerati dall’ ospite in cui si slatentizzano di tanto in tanto. • GAG: proteine strutturali; POL: polimerasi; ENV: proteine di superficie. • 83 KB di Dna eterologo che si può inserire nel genoma.

15. Prolonged transgene expression. • Ridotti livelli di espressione. • Le proteine di superficie hanno recettori specifici sulle membrane cellulari, per cui entrano più facilmente in alcuni tessuti che in altri. • Vengono rapidamente eliminati dal circolo. • Molto usati ex vivo, poco usati in vivo.

16. Virus Adeno Associati (AAV) • Parvovirus. • Necessitano di un helper. • 6 sierotipi, si usa il 2. • Non ci sono malattie associati agli AAV. • Nel genoma ci sono 2 geni che producono multipli polipeptidi: • REP produce prodotti per la replicazione. • CAP produce proteine strutturali.

17. REP permette l’ integrazione nel cromosoma 19. • Espressione lenta ma duratura • 5.0 KB di spazio. • Pro: espressione stabile e duratura. • Contro: poco spazio, difficile da produrre su larga scala.

18. Studi clinici • Malattia: Ischemia (Miocardio,Claudicatio intermittens). • Gene: VEGF. • Transfer: in vivo. • Vettore: Dna nudo. • Risultati: VEGF è un fattore solubile. L’iniezione di DNA nudo IM conduce all’aumento dei livelli circolanti del fattore induzione della neoangiogenesi. Rivascolarizzazione eterotropa del vaso. • Obiezioni: Studio in fase 1, mancano i controlli. Per il miocardio, mancano evidenze angiografiche di rivascolarizzazione, solo evidenze “morfologiche e funzionali” ottenute alla scintigrafia.

19. Studi di fase I/II per valutare la tossicità • 1° studio: Malattia SCID. • Gene: ADA. • Transfer: ex vivo in T Cell. • Vettore: LASN (Retrovirus). • Risultato: miglioramento del quadro clinico • Obiezioni: scarso numero di pazienti (n=2) assenza di controlli. La terapia tradizionale non fu discontinuata. • NIH trial. • Telethon study.

20. Caso Gelsinger • Malattia: Iperammonemia. • Gete: OTC (Ornithyne Transcarbamylase). • Transfer: in vivo, target: il Fegato. • Vettore : Adenovirus, replicatio deficient. • Risultato: morte per ARDS nell’ ambito di SIDS.

21. Gene therapy in Hypertension • L’ ipertensione è una sindrome (malattia) a trasmissione familiare, ma multifattoriale. Probabilmente più di un gene vi è coinvolto e alcuni geni in certi tipi di ipertensione sono più colpevoli di altri. • Si definisce iperteso: Sistolica >140 mmHg. Diastolica > 90 mmHg

22. Condizioni cliniche che derivano dall’ipertensione • Stroke • Cardiopatia ipertrofica e poi dilatativa. • Cardiopatia ischemica. • Arterosclerosi. • Insufficienza renale.